[发明专利]一种稳定性提高的普鲁兰酶突变体及其构建方法

说明书

本发明公开了一种稳定性提高的普鲁兰酶突变体及其构建方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明在高酶活长野芽胞杆菌来源普鲁兰酶的基础上，筛选获得两株单点热稳定性提高的突变菌株D147F，G690M以及一株组合突变体D147F/G690M。且突变体在热稳定显著提高的同时，酶的活性不受影响。本发明中的这些突变体比天然普鲁兰酶更适用于工业生产，具有非常巨大的应用前景和产业价值。

技术领域

本发明涉及一种稳定性提高的普鲁兰酶突变体及其构建方法，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

低聚异麦芽糖(isomaltooligosaccharides，IMOs)是一类功能性低聚糖，由2～10个α-1、6-糖苷键连接的葡萄糖基组成，包括异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖等主要功能成分。IMOs可促进双歧杆菌和乳酸杆菌等益生菌在人体肠道中的增殖，调节肠道菌群；有低热量值，促进胃肠蠕动，改善便秘和脂质代谢，防龋齿等功能，因此，IMOs被广泛用作益生素、食品添加剂和饲料成分。

普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)是淀粉脱支酶之一，能专一性地水解淀粉分支点上的α-1，6糖苷键，释放直链淀粉，有利于糖化酶的淀粉糖化与葡萄糖生成，从而显著提升淀粉糖化效率与淀粉到葡萄糖的转化率，是淀粉制糖工业中重要且不可或缺的辅助用酶。从20世纪80年代起，国外学者相继发现与解析了多种不同来源的普鲁兰酶。但是至今为止，在淀粉制糖工业中，仅Ⅰ型普鲁兰酶呈现出较好的与糖化酶复配或复合的作用。其中，长野芽胞杆菌(Bacillus naganoensis)普鲁兰酶(PulA)具有较高的催化活性，具备现实工业应用价值。

目前，一般通过酶促转化的方法生产IMOs，利用α-淀粉酶、β-淀粉酶、普鲁兰酶和葡萄糖苷酶从淀粉中催化生产，其典型的生产过程通常包括3个步骤：一是液化，其中淀粉被耐热α-淀粉酶液化产生低聚糖和糊精；二是糖化，低聚糖和糊精被β-淀粉酶和普鲁兰酶等糖化酶糖化；三是转糖基化，α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)可催化葡萄糖从底物的非还原末端释放，并将葡萄糖基残基转移到非还原葡萄糖单位的6-OH基团，产生IMOs。

大多数研究只是通过固定化酶或细胞表面展示来提高酶的热稳定性，但它们的热稳定性在工业应用中仍然令人不甚满意。因此，对普鲁兰酶进行分子修饰以提高其热稳定性的研究将是本发明的研究重点。

发明内容

为了解决目前普鲁兰酶热稳定性不高的问题，本发明提供了一种普鲁兰酶突变体，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第147位和/或第690位的氨基酸进行突变得到的。

在一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第147位的天冬氨酸突变为苯丙氨酸得到的，命名为：D147F，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第690位的甘氨酸突变为甲硫氨酸得到的，命名为：G690M，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第147位天冬氨酸突变为苯丙氨酸，并将第690位的甘氨酸突变为甲硫氨酸得到的，命名为：

D147F/G690M，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种制备上述任一所述突变体的方法，包括如下步骤：

(1)以SEQ ID NO.5所示核苷酸序列为模板，设计定点突变引物，进行PCR扩增获得含有突变位点的基因，将所述基因与载体连接构建重组表达载体；

(2)将步骤(1)构建的重组表达载体转化到宿主细胞内。

本发明还提供了编码所述突变体的基因。