[发明专利]粮谷物及其制品中黄曲霉毒素B1荧光免疫定量POCT检测方法

权利要求书

1.一种粮谷物及其制品中黄曲霉毒素B1荧光免疫定量POCT检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)微球标记AFB1单克隆抗体

取荧光聚苯乙烯微球加入BB缓冲液超声；之后先加入NHS混匀，再加入EDC避光混匀；室温下离心20min后，弃去上清，加入PBS缓冲液，超声，微球均匀分散至缓冲液中；加入AFB1单克隆抗体，避光混匀；加入BSA，再摇匀，离心20min，弃上清，加入TRIS溶解，2-8℃避光保存备用；

2)包被膜和结合垫的制备

取硝酸纤维素膜(NC膜)包被检测线(T线)和质控线(C线)，包被量为1μL/cm；T线包被AFB1-BSA，浓度为0.5mg/ml；C线包被羊抗鼠二抗，浓度为0.3mg/ml；放37℃烘箱烘干，完成包被膜制备；取玻璃纤维结合垫，预处理后裁成8mm*300mm，将微球抗体偶联物稀释5倍后，按照4μL/cm喷结合垫；真空干燥后完成结合垫制备；

3)时间分辨荧光免疫层析试纸条的组装

以PVC胶粘板为底板，依次粘贴NC膜、结合垫、样品垫和吸水纸，相邻组分间重叠1-2mm；使用微电脑自动斩切机将试纸条裁成3.7mm宽度的试纸条，装入卡壳，压壳后放入铝箔袋，加入干燥剂封口，置阴凉干燥处保存备用；

4)检测

取80μL的待测样本至检测卡加样孔中，计时反应15min；将检测卡插入荧光免疫层析读数仪，10s内读取待测样本浓度值。

2.如权利要求1所述的一种粮谷物及其制品中黄曲霉毒素B1荧光免疫定量POCT检测方法，其特征在于，步骤1)中，聚苯乙烯微球的粒径200nm、固含量1％，BB缓冲液浓度为0.01M、pH 7.8，BSA的浓度为20mg/mL；荧光聚苯乙烯微球与BB缓冲液、NHS、EDC、AFB1、BSA的用量比为50μL：450μL：10μL：10μL：40μg：100μL。

3.如权利要求1所述的一种粮谷物及其制品中黄曲霉毒素B1荧光免疫定量POCT检测方法，其特征在于，步骤1)中，NHS和EDC的浓度分别为20mg/ml。

4.如权利要求2所述的一种粮谷物及其制品中黄曲霉毒素B1荧光免疫定量POCT检测方法，其特征在于，所述标准曲线的建立方法为：

a)用含10％甲醇的0.01M pH7.4 PBS准确配制终浓度为0ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml的标准溶液；

b)分别取80μL加入检测卡加样孔，每个浓度重复2次，反应15min后按照滴卡顺序插入荧光免疫分析检测仪读取T线和C线的荧光强度，计算T/C值；

c)以加入标准溶液的浓度为X轴，T/C值为Y轴，通过ELISA Calc回归/拟合计算程序中Logistic曲线拟合(四参数法)制作标准曲线。

5.如权利要求3所述的一种粮谷物及其制品中黄曲霉毒素B1荧光免疫定量POCT检测方法，其特征在于，所述标准曲线拟合时，以标准品的浓度为X轴，T/C值为Y轴，通过Logistic拟合曲线(四参数法)，曲线为y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D，其中A＝10.21，B＝1.52，C＝0.07，D＝0.19，标曲拟合度R²＝0.9935。

6.如权利要求1所述的一种粮谷物及其制品中黄曲霉毒素B1荧光免疫定量POCT检测方法，其特征在于，步骤4)中，待测样本前处理的方法为：将甲醇与PBS按照体积比6:4配制溶液作为提取液；精确称量5.0±0.02g粉碎后样本放入50mL离心管中，向离心管中加入25mL提取液，于漩涡混匀器上振荡混匀5min，然后以6000rpm/min的转速离心5min；接下来取上清液100μL于新的1.5mL离心管中，再加入300μL PBS缓冲液，混匀即可。