[发明专利]用于32种病毒检测的引物组合和扩增子靶向测序方法

说明书

本发明公开了一种用于32种病毒检测的引物组合，包括上游引物F1：5’‑GAACGACATGGCTACGATCCGACTT special F‑3’，下游引物R1：5’‑GACCGCTTGGCCTCCGACTT special R‑3’，其中special F包括序列表中的序列1‑126中的单数序列，special R包括序列表中的序列1‑126中的双数序列。本发明的方法可以快速鉴定样本中是否存在32种病毒中的一种或若干种，样本检测限可低至5ng，检测准确率高，在95％以上，无携带污染。本发明可以同时对DNA和RNA两种类型的核酸进行检测，将RNA的反转录和DNA的扩增在同一个反应内完成，大大简化了操作流程。

技术领域

本发明涉及用于32种病毒检测的引物组合和扩增子靶向测序方法。

背景技术

NGS，即下一代测序技术(Next-generation sequencing technology)又称高通量测序技术(High-throughput sequencing)，能一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定但读长一般较短。在病原检测中，利用NGS技术可直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，然后与数据库进行比对，实现感染性疾病的溯源、检测、分型和耐药评估等多个方面。基于NGS鉴别微生物的主要方法有两种，分别是宏基因组测序(metagenomic NGS，mNGS)和靶向测序(targeted NGS,tNGS)。

mNGS直接对临床样本中的核酸进行无差别、无选择性的高通量测序，能够快速、客观的检测临床样本中的较多病原微生物，能够检测出新发和罕见病原体，它在重症感染领域，特别是疑难、罕见病导致的重症感染中发挥了难以替代的作用。但mNGS检测结果的灵敏度受宿主及其他微生物背景核酸的影响较大，且成本较高。在组织样本中，人源DNA的含量会在99％以上，这对样本的去除人源背景和测序通量提出来一定的要求。

相比于mNGS，tNGS是通过(超)多重PCR或杂交捕获的方式检测样本中已知病原微生物，可以提高灵敏及降低测序成本。tNGS检测目标仅包含预先设定的病原体，特异性富集待检靶标基因，因此不会受到人源核酸和背景菌群的影响。通过特异性引物或探针的设计，一次可富集几百到几千个靶标片段，能够实现病毒、细菌和耐药检测单管建库，无需RNA和DNA分别建库。这种方法相比于mNGS测序成本低，对丰度低的病毒和突变检测具有更高的灵敏性。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于32种病毒检测的引物组合。

本发明采取的技术方案为：一种用于32种病毒检测的引物组合，包括

上游引物F1：5’-GAACGACATGGCTACGATCCGACTT special F-3’

下游引物R1：5’-GACCGCTTGGCCTCCGACTT special R-3’，其中special F包括序列表中的Seq-1-108中的单数序列，special R包括序列表中的Seq-1-108中的双数序列。

上述的引物组合还包括：

随机引物N9：NNNNNNNNN。

上述的引物组合还包括：

第二轮扩增上游通用引物

F2：5’-GAACGACATGGCTACGA-3’(Seq-109)

第二轮扩增下游BC引物

R2-MGI_BC：5’-TGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGA-3’(Seq-110)，其中NNNNNNNNNN为barcode区域。

本发明还公开了一种用于32种病毒检测的扩增子靶向测序方法，其步骤包括：