[发明专利]表达牛巨噬细胞粒细胞集落刺激因子的重组乳酸菌及应用

权利要求书

1.一种表达牛巨噬细胞粒细胞集落刺激因子的重组乳酸菌，其特征在于，是由下列步骤得到的：

(1)牛粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF基因的扩增

按照牛粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF基因的编码区合成质粒，GeneID:281095，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，将GM-CSF质粒以热转化方式，将其转化至感受态细胞中，感受态细胞冰浴10min复苏，将质粒与感受态混合均匀，冰浴30min，然后42℃水浴45s，冰浴3min，加入LB培养基800μl，37℃震荡培养45min，涂于AMP50μg/ml的LB琼脂平板，37℃培养过夜，第二天挑取阳性菌落并提取质粒，并送往测序公司测序；

(2)pPG-GM-CSF重组克隆质粒的构建

(2.1)GM-CSF基因回收

将扩增的到的GM-CSF基因利用Primer5.0设计特异性引物，其两端设计酶切位点，如下：

P1：5＇GCCGAATTCGTAAAACGACGGCCAGT3＇(EcoRI)，

P2：5＇CGCGATATCCACACAGGAAACAGCTATGAC3＇(EcoRV)

该引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，PCR后电泳检测扩增产物，利用琼脂糖凝胶试剂盒回收PCR扩增的目的基因；PCR反应体系如下：

(2.2)pPG612.1乳酸菌/乳酸杆菌分泌型表达载体双酶切

复苏pPG612.1乳酸菌/乳酸杆菌分泌型表达载体质粒的大肠杆菌，37℃恒温培养5h后提取质粒；使用EcoRI和EcoRV限制性核酸内切酶进行双酶切，置于金属浴中37℃反应15min，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，并纯化回收载体片段送往测序，酶切反应体系如下：

(2.3)重组质粒pPG612.1-GM-CSF的构建

使用T₄DNA连接酶将纯化后的GM-CSF与pPG612.1载体进行连接并转化至感受态中，利用含氯霉素的LB琼脂平板筛选阳性菌落，挑取疑似阳性单菌落置于含5μg/ml氯霉素的液体LB培养基中培养7h，连接反应体系如下：

(3)重组质粒pPG-GM-CSF电转化至约氏乳杆菌

(3.1)约氏乳杆菌感受态制备

-80℃保存的菌种接种于MRS培养基37℃厌氧复苏8h，复苏后取100μl菌液接种于MRS平板，30℃厌氧培养20h，挑取单菌落接种于400mlMRS培养基培养至OD＝0.5，冰浴25min；4℃7000rpm离心8min；弃上清，20mlEPWB重悬，4℃7000rpm离心8min，重复两次；弃上清，15mlEPB重悬，4℃7000rpm离心8min；弃上清，2mlEPB重悬，200μl/管分装，-80℃保存备用；

(3.2)重组质粒pPG-GM-CSF电转化至约氏乳杆菌

将约氏乳杆菌感受态置于冰水混合物中复苏10min；将5μlpPG-GM-CSF重组质粒与100μl约氏乳杆菌感受态轻弹混匀；冰浴5min后转入预冷的电击杯静置2min，2.1kV，3ms电击；电击后立即冰浴10min；加入含15％蔗糖的MRS培养基1000ml；37℃厌氧培养2h，3000rpm离心10min，弃上清；200μlMRS重悬菌体后涂布于10μg/ml氯霉素MRS平板，置于37℃恒温箱厌氧培养过夜。

2.如权利要求1所述的一种表达牛巨噬细胞粒细胞集落刺激因子的重组乳酸菌在预防牛子宫内膜炎中的应用。

3.一种预防牛子宫内膜炎的微生态制剂，其特征在于：由表达牛巨噬细胞粒细胞集落刺激因子的重组乳酸菌和基础保护剂组成。

4.根据权利要求3所述的一种预防牛子宫内膜炎的微生态制剂，其特征在于：所述基础保护剂包括可溶性淀粉100g/L，脱脂奶粉30g/L和甘油20g/L。