[发明专利]表达牛巨噬细胞粒细胞集落刺激因子的重组乳酸菌及应用

说明书

本发明涉及表达牛巨噬细胞粒细胞集落刺激因子的重组乳酸菌及应用，属于生物工程技术领域。包括牛粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM‑CSF基因的扩增，pPG‑GM‑CSF重组克隆质粒的构建，重组质粒pPG‑GM‑CSF电转化至约氏乳杆菌。本发明优点是：表达牛巨噬细胞粒细胞集落刺激因子的重组乳酸菌在预防牛子宫内膜炎中的应用，所用乳酸菌具有优异的生殖道抑菌活性，在乳酸菌中表达牛源GM‑CSF，不仅能够叠加乳酸菌的菌群调节功能和GM‑CSF免疫提升作用，也使昂贵且疗效好的GM‑CSF能够用于兽药。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及表达牛巨噬细胞粒细胞集落刺激因子的重组乳酸菌及应用，用于预防牛产后子宫内膜炎的发生。

背景技术

多达50％的奶牛产后受到子宫炎等生殖道疾病的影响，产犊后免疫功能暂时下降及营养代谢的紊乱是导致生殖道疾病风险增加的重要原因。目前通常采用抗生素疗法，但其耐药性及子宫内膜炎对牛繁殖能力造成的不可逆影响，让人们认识到提高妊娠母牛免疫力，预防子宫内膜炎等生殖道疾病的发生更为重要。

中性粒细胞是生殖道最丰富的炎症细胞类型，是抵御子宫感染的主要防线。产犊后中性粒细胞功能及数量的显著降低，被认为是免疫功能下降的主要原因，因此，刺激中性粒细胞功能是抵御产后子宫炎症的重要途径。巨噬细胞粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)作为一种多潜能细胞趋化因子，广泛存在于雌性动物生殖道中，可以大量动员髓系白细胞进入子宫内膜，调节子宫和蜕膜组织中巨噬细胞、粒细胞和树突状细胞的迁移和激活，在胚胎着床、胎盘发育及内膜重建过程中，促进组织重塑提高子宫内膜免疫功能，预防产后生殖道疾病的发生和内膜的重建。GM-CSF已在人医临床中成功应用，但是由于其价格昂贵(≥800元/μg)，无法用于兽药。

乳酸菌是一类非产孢、革兰氏阳性、微需氧、非流动和过氧化氢酶阴性的微生物，主要特点是能够以碳水化合物为原料产生乳酸。乳酸菌具有安全、高效、广谱递呈抗原等优点，对生殖道健康具有重要的调节作用。目前已有许多细菌、病毒抗原在重组乳酸菌中也已成功表达，并且乳酸菌本身就是子宫微生物菌群的一部分，对其子宫内微生物稳态还会起到一定增强作用。

发明内容

本发明提供一种表达牛巨噬细胞粒细胞集落刺激因子的重组乳酸菌及应用，用于开发一种表达粒细胞集落刺激因子的乳酸菌微生态制剂，产前接种以刺激产犊后母牛的免疫功能，预防子宫内膜炎等生殖道疾病的发生。

本发明采取的技术方案是，表达牛巨噬细胞粒细胞集落刺激因子的重组乳酸菌是由下列步骤得到的：

(1)牛粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF基因的扩增

按照牛粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF基因的编码区(GeneID:281095)合成质粒，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，将GM-CSF质粒以热转化方式，将其转化至感受态细胞中，感受态细胞冰浴10min复苏，将质粒与感受态混合均匀，冰浴30min，然后42℃水浴45s，冰浴3min，加入LB培养基800μl，37℃震荡培养45min，涂于AMP50μg/ml的LB琼脂平板，37℃培养过夜，第二天挑取阳性菌落并提取质粒，并送往测序公司测序；

(2)pPG-GM-CSF重组克隆质粒的构建

(2.1)GM-CSF基因回收

将扩增的到的GM-CSF基因利用Primer5.0设计特异性引物，其两端设计酶切位点，如下：

P1：5＇GCCGAATTCGTAAAACGACGGCCAGT3＇(EcoRI)，

P2：5＇CGCGATATCCACACAGGAAACAGCTATGAC3＇(EcoRV)

该引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，PCR后电泳检测扩增产物，利用琼脂糖凝胶试剂盒回收PCR扩增的目的基因；PCR反应体系如下：