[发明专利]一种检测β-内酰胺类耐药基因PBPs的引物、方法和应用

说明书

本发明提供了一种检测β‑内酰胺类耐药基因PBPs的引物、方法和应用，其包括扩增PBP1、PBP2、PBP3的PBPs中三种亚型的引物；采用PCR加Sanger测序的技术。本发明可快速地将三种PBPs的亚型全长序列检测出来，并且通过与标准序列比对，快速准确判断突变情况，从而确定β‑内酰胺类耐药情况，为治疗幽门螺杆菌提供依据。

技术领域

本发明属于分子检测领域，特别涉及一种检测β-内酰胺类(如阿莫西林)耐药基因PBPs的引物、方法和在试剂盒上的应用。

背景技术

阿莫西林是临床上唯一用于根除H.pylori的β-内酰胺类药物，也是各种三联或四联疗法中最常应用的抗生素。既往由于在阿莫西林耐药的H.pylori菌株中未检测到β-内酰胺酶活性，故认为H.pylori对阿莫西林的耐药与β-内酰胺酶无关，目前国内外大多数研究认为青霉素结合蛋白(Penicinin binding Proteins，PBPs)突变才是导致H.pylori对阿莫西林耐药的最主要原因。在已发现的3种高分子质量PBPs(PBP1、PBP2、PBP3)和6种低相对分子质量PBPs中，3种高相对分子质量PBPs突变被证实与H.pylori对阿莫西林的耐药有关，其中PBP1的突变在H.pylori对阿莫西林的耐药中所起的作用最为重要。Qureshi等研究显示H.pylori对阿莫西林的耐药主要与PBP1的突变有关，Ser414Arg、Thr556Ser和Asn562是PBP1中最常见的3个氨基酸置换，提示针对这3个突变位点的检测将有助于发现PBP1突变。国内朱振华等的研究也证实PBP1突变是H.pylori阿莫西林耐药的主要原因。Rimbara等研究证实PBP1、PBP2和PBP3的突变均与H.pylori对阿莫西林耐药有关，在PBP1突变的基础上PBP2和PBP3的突变进一步提高了H.pylori对阿莫西林的耐药水平。总之，PBPs突变是目前H.pylori对阿莫西林耐药的主要机制。临床上对于PBP1、PBP2和PBP3突变的检测，尤其是对PBP1突变的检测将有助于鉴别阿莫西林耐药株，避免阿莫西林耐药，导致治疗失败。

常规的药物敏感性分析，采用培养的方法，该方法操作繁琐，耗时长，需要3-7天的时间。PCR方法简单，快速，成本低，产物通过测序判断突变直观准确；样本的要求也不高，不需要活菌；如果是组织的话，只要少量的组织新鲜或石蜡包埋都可，所以本发明采用传统的PCR加一代测序检测幽门螺杆菌的PBPs的突变情况，从而判断β-内酰胺类药物在治疗幽门螺杆菌过程中耐药情况，为临床的个性话用药提供理论依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测β-内酰胺类(如阿莫西林)耐药基因PBPs的引物，方法和应用，采用PCR加Sanger测序技术，可用于快速检测幽门螺杆菌PBPs基因的突变情况,从而判断β-内酰胺类(如阿莫西林)治疗幽门螺杆菌的疗效。

一种检测β-内酰胺类(如阿莫西林)耐药基因PBPs的引物，包括扩增PBPs基因的引物，其碱基序列为：

PBP1-F1：TGTAAAACGACGGCCAGTGATTTTTTATGGTTTTATCGTTTTATTTT

PBP1-R1：AACAGCTATGACCATGGCCATAATACCCATGCCCAA

PBP1-F2：TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTTTTGGGCATGGGTATTATG

PBP1-R2：AACAGCTATGACCATGGTTGGTAATCCAAATCTATCGTGAG

PBP1-F3：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCACGATAGATTTGGATTACCAAC

PBP1-R3：AACAGCTATGACCATGTGYAAGGTTACAAGCCCTAAAA

PBP1-F4：TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTAGGGCTTGTAACCTTRCA