[发明专利]一种基于核苷酸二聚体为单体的合成测序方法

权利要求书

1.一种基于核苷酸二聚体为单体的合成测序方法，其特征在于：合成测序的核苷酸为核苷酸二聚体，在聚合酶的作用下，核苷酸二聚体如果与测序引物杂交的DNA模板中两个碱基完全配对，则发生核苷酸二聚体的聚合反应，测序引物延伸两个碱基；如果与DNA模板中两个碱基不完全配对，则不发生核苷酸二聚体的聚合反应。

2.根据权利要求1所述的基于核苷酸二聚体为单体的合成测序方法，其特征在于：所述核苷酸二聚体的基本结构为两个相同或者不同的核苷酸通过磷酸酯键相连接，其5’端还包括一个三磷酸基团，核苷酸二聚体包括十六种具体形式即：AA、CC、GG、TT、AC、CA、GT、TG、AG、GA、CT、TC、AT、TA、CG、GC。

3.根据权利要求1所述的基于核苷酸二聚体为单体的合成测序方法，其特征在于：所述核苷酸二聚体3’端羟基被包括3’-O-烯丙基、3’-O-氰乙基、3’-O-叠氮甲基、3’-O-氨基基团封闭，这些3’端修饰的核苷酸二聚体能够参与合成测序反应，且最多只能发生一个核苷酸二聚体的合成，3’端封闭基团在合适的反应条件下可以被脱出、并活化出核苷酸的3’端羟基。

4.根据权利要求1或3所述的基于核苷酸二聚体为单体的合成测序方法，其特征在于：所述核苷酸二聚体是用染料标记的，标记的位置可以是5’端碱基位置、5’端磷酸末端、或者3’端羟基位置，特别地，当3’端羟基位置时，可以用染料替代封闭基团的作用。

5.根据权利要求1或4所述的基于核苷酸二聚体为单体的合成测序方法，其特征在于：AA、CC、GG、TT均用第一种染料标记，AC、CA、GT、TG均用第二种染料标记，AG、GA、CT、TC均用第三种染料标记，AT、TA、CG、GC均用第四种染料标记，四种染料的发射波长不能相互干扰，且这些标记的染料可以通过化学或者光化学方法切割，切割后不影响DNA序列的生物化学功能。

6.根据权利要求1所述的基于核苷酸二聚体为单体的合成测序方法，其特征在于：待测DNA模板片段是指单分子，或者以单分子为模板扩增的相同序列产物，待测DNA模板包括可以是一种序列，也可是不同DNA模板的阵列。

7.根据权利要求1所述的基于核苷酸二聚体为单体的合成测序方法，其特征在于：待测DNA模板信息的获得是通过比较染料的荧光强度与背景数值来确定的，当包含测序模板一个已知碱基中四种标记染料中最强的荧光强度明显高于背景数值时，可以确定该DNA模板为有效测序模板、并记录该DNA的荧光强度以及位置坐标信息。

8.根据权利要求1所述的基于核苷酸二聚体为单体的合成测序方法，其特征在于：待测DNA模板的具体碱基信息是通过两轮测序来实现的，每轮测序获得具体的染料或者编码信息，两轮测序的测序引物相差一个碱基，其中一轮测序的测序引物对应测序模板一个已知的碱基，待测DNA模板具体碱基信息是通过测序模板一个已知的碱基而依次解码二组碱基片段编码信息而得到的，对于有参考序列的基因组测序的再测序，两组核苷酸实时合成DNA测序得到的编码即可以直接用于基因组参考序列的比对，而不需要对编码进行解码，而实现对基因组序列的再测序。

9.根据权利要求1-8任一项所述的基于核苷酸二聚体为单体的合成测序方法，其特征在于：包括如下步骤：

A：大肠杆菌基因组全基因组模板制备：将目标基因组用超声破碎成大小为100-1000bp碱基的片段，并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对序列已知道的通用连接子进行连接，其中连接子1的序列为：CTG CTG TAC CGT ACA GCC TTG GCC G，连接子2的序列为：CGC TTT CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTGAT；并进行预扩增；然后凝胶电泳切割200-800bp DNA片段，并纯化；将这些200-800bp DNA片段进行乳液并行PCR反应或者桥式PCR，扩增片段化的大肠杆菌基因组片段、构建大肠杆菌基因组测序DNA模板芯片上；

B：第一轮测序

a、测序引物杂交：将5’端固定的模板与能和3’端连接子互补的第一个引物杂交，杂交引物作为所有大肠杆菌基因组DNA模板的测序引物；

b、测序

(1)将四色标记的16个3’-O--叠氮甲基修饰的核苷酸二聚体和包括9°DNA聚合酶的测序体系加入到反应池中进行合成测序反应，然后用乙二胺四乙酸二钠缓冲液洗涤未参与反应的标记核苷酸二聚体，成像、记录包含测序模板一个已知碱基中四种标记染料中最强的荧光强度明显高于背景数值时、确定该DNA模板为有效测序模板、并记录该DNA的荧光强度以及位置坐标信息；

(2)加入三(2-羧乙基)膦反应，然后用M EDTA缓冲液洗涤；

(3)按照上述(1)～(2)步骤循环进行合成测序反应，得到一组由编码1、2、3、4构成的测序信息，然后进行第二轮测序反应；

C：第二轮测序

a、用尿素处理，将第一轮测序反应中的测序引物、及其测序引物合成链清除，重新得到单链DNA模板；

b、测序引物杂交：将5’端固定的模板与能和3’端连接子互补的第二个引物杂交，杂交引物作为所有大肠杆菌基因组DNA模板的测序引物；

c、测序

(1)将四色标记的16个3’-O--叠氮甲基修饰的核苷酸二聚体和包括9°DNA聚合酶的测序体系加入到反应池中进行合成测序反应，然后用乙二胺四乙酸二钠缓冲液洗涤未参与反应的标记核苷酸二聚体，成像、记录包含测序模板一个已知碱基中四种标记染料中最强的荧光强度明显高于背景数值时、确定该DNA模板为有效测序模板、并记录该DNA的荧光强度以及位置坐标信息；

(2)加入三(2-羧乙基)膦，然后用EDTA缓冲液洗涤；

(3)按照上述(1)～(2)步骤循环进行合成测序反应，得到一组由编码1、2、3、4构成的测序信息，然后进行第二轮测序反应；

D、解码

利用每个模板两轮测序中得到的核苷酸二聚体编码信息，并利用包含测序模板一个已知碱基的核苷酸二聚体编码信息、解码组装出每个模板相应的碱基序列信息；

E、序列组装

利用所有模板的碱基序列信息、并利用纠错及其SNP识别原理，组装成大肠杆菌基因组序列。