[发明专利]一种基于核苷酸二聚体为单体的合成测序方法

说明书

本发明公开了一种基于核苷酸二聚体为单体的合成测序方法，合成测序的核苷酸为核苷酸二聚体，在聚合酶的作用下，核苷酸二聚体如果与测序引物杂交的DNA模板中两个碱基完全配对，则发生核苷酸二聚体的聚合反应，测序引物延伸两个碱基；如果与DNA模板中两个碱基不完全配对，则不发生核苷酸二聚体的聚合反应。该方法提高序列测定的长度及准确度，实现待测核酸序列的高通量检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种基于核苷酸二聚体为单体实现核酸序列高通量合成测序方法。

背景技术

DNA测序技术是分子生物学研究中最常用的技术，它的出现极大地推动了生物学的发展。最近几年发展起来的第二代DNA测序技术则使得DNA测序进入了高通量、低成本的时代。高通量测序技术是对传统测序技术的一次革命性提高，一次能同时对几百万甚至几千万条DNA序列进行测序。目前主流的二代高通量测序技术主要有四个代表：Illumina公司的Solexa测序合成技术、Roche公司的454合成测序技术、ABI公司IonTorrent合成测序技术以及SOLiD测序技术。然而，目前高通量DNA测序平台、尤其是主流的高通量DNA测序平台仍然存在着较大的错误率。高错误率使得检测单核苷酸多态性(SNP)或低丰度突变极其困难，限制了高通量DNA测序平台的临床应用，例如主要基于SNP的药物基因组学研究和主要基于低丰度突变的早期临床诊断。目前，Sanger测序因其准确度高(99.999％)仍被认为是金标准，高通量DNA测序平台的结果需要在临床实践中通过桑格测序进行验证。

在现有的高通量DNA测序平台中，虽然SOLiD连接测序平台由于测序时间、测序长度等方面的原因使得其实际应用受到限制，但其原始测序错误效率则分别比NextSeq、454GS FLX和Ion Torrent的合成测序平台低13、16、30和倍，是高通量DNA测序平台最高的，而在15×测序深度下准确率可达99.999％，达到桑格测序因其准确度。SOLiD测序技术的测序错误效率低是由于所有位置的碱基都检测两次，这使得该方法具有纠错和发现SNP/突变位点的特点，即碱基检测两次的信息可以提供固有的校对功能，从而减少原始数据中的错误。

针对现有二代高通量DNA合成测序平台测序错误率高的问题，本发明以核苷酸二聚体作为测序单体，通过两轮DNA测序，即所有碱基检测两次的信息提供校对功能，从而减少原始数据中的错误，提高测序的准确性。本发明有助于提高高通量DNA测序的准确性、提升测序长度，拓展高通量DNA测序技术在识别低丰度序列的能力，拓展高通量DNA测序技术在生物科学研究和临床早期诊断的进一步应用。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供一种3’端羟基可逆封闭核苷酸二聚体合成测序法，该方法提高序列测定的长度及准确度，实现待测核酸序列的高通量检测。

技术方案：3’端羟基可逆封闭核苷酸二聚体合成测序法，在聚合酶的作用下，核苷酸二聚体如果与测序引物杂交的DNA模板中两个碱基完全配对，则发生核苷酸二聚体的聚合反应，测序引物延伸两个碱基；如果与DNA模板中两个碱基不完全配对，则不发生核苷酸二聚体的聚合反应。

进一步地，所述核苷酸二聚体的基本结构为两个相同或者不同的核苷酸通过磷酸酯键相连接、其中5’端还包括一个三磷酸基团。核苷酸二聚体包括十六种具体形式、即AA、CC、GG、TT、AC、CA、GT、TG、AG、GA、CT、TC、AT、TA、CG、GC。

进一步地，所述核苷酸二聚体3’端羟基是被包括3’-O-烯丙基、3’-O-氰乙基、3’-O-叠氮甲基、3’-O-氨基等基团封闭。这些3’端修饰的核苷酸二聚体能够参与合成测序反应、且最多只能发生一个核苷酸二聚体的合成。3’端封闭基团在合适的反应条件下可以被脱出、并活化出核苷酸的3’端羟基。