[发明专利]一种从青枯菌中筛选抗青枯病的胞外核酸酶的方法及遗传改良应用

说明书

本发明属于遗传转化技术领域，具体涉及一种从青枯菌中筛选抗青枯病的胞外核酸酶的方法及遗传改良应用。本发明对所述核酸酶进行基因敲除，结果显示敲除后青枯菌的表型发生变化且致病力降低，与野生型菌株的竞争力也减弱。实施例中将RuvC在感病番茄品种MoneyMarker中进行超量表达，转化后的植物可显著提高番茄对青枯病的抵抗能力，有利于番茄抗性品种的选育，并且也在拟南芥和烟草中成功表达，且没有影响作物本身正常生长，具有应用于更多作物抗病育种的潜力。

技术领域

本发明属于遗传转化技术领域，具体涉及一种从青枯菌中筛选抗青枯病的胞外核酸酶的方法及遗传改良应用。

背景技术

番茄青枯病是由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的细菌性土传病害，是危害农业生产最严重的细菌性病害之一。青枯菌通过植株伤口或是自然孔口从根部侵入，定殖于木质部，入侵维管束，阻碍水分的运输，导致植株萎蔫最终死亡。青枯菌寄主包括番茄、烟草、马铃薯等数百种作物，且青枯菌具备强大的适应能力，为青枯菌的遗传变异提供了适宜的选择压力。

目前关于番茄青枯病的防治研究主要集中在抗病品种选育、农业防治、生物防治、化学防治等方面。生产上主要依靠农药来防治，然而长期用药会增加青枯菌的抗药性，随之加大用量，造成恶性循环，而且化学农药的长期使用对环境和人体健康均不友好。农业防治可以起到较好的预防作用，却不能有效从根本上阻止病势扩大蔓延。近年来科研工作者将对于青枯病生防菌的筛选和防效评估作为工作重点，然而从小区试验到大田试验仍然会受到土壤微生物、温湿度、栽培条件等的影响，导致不同区域防效差异加大。相比之下选育抗病品种是较为经济、安全、可观的策略，寻找抗病相关基因资源是抗青枯病遗传育种的重要方向之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从青枯菌中筛选抗青枯病的胞外核酸酶的方法及遗传改良应用，筛选得到的胞外核酸酶RuvC来源于青枯菌自身，可以方便、安全、有效的应用于遗传育种，在一定程度上降低抗性品种抗性丧失的概率。

本发明提供了一种从青枯菌中筛选抗青枯病的胞外核酸酶的方法，包括以下步骤：从青枯菌基因组中筛选与胞外类Holliday Junction结构相关的结合蛋白，得核酸酶；

敲除青枯菌基因组中所述核酸酶的基因，当基因敲除菌的表型发生变化且致病力降低，与野生型菌株的竞争力减弱时，所述核酸酶即为所述抗青枯病的胞外核酸酶RuvC。

优选的，所述青枯菌基因组包括青枯菌模式菌株GMI1000基因组。

优选的，所述敲除的方法包括自然转化法。

优选的，筛选得到所述胞外核酸酶RuvC后，还包括将体外纯化的所述胞外核酸酶RuvC与生物膜混合，验证所述胞外核酸酶RuvC对生物膜的抑制作用。

优选的，所述胞外核酸酶RuvC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了利用上述方法筛选得到的抗青枯病的胞外核酸酶的编码基因RuvC在构建抗青枯菌物种中的应用。

优选的，所述构建抗青枯菌物种的方法包括遗传转化。

优选的，所述抗青枯菌物种包括抗青枯菌的植物和微生物。

优选的，所述植物来源于十字花科和茄科。

本发明还提供了一种构建抗青枯菌物种的方法，包括将抗青枯病的胞外核酸酶的编码基因RuvC、表达盒或表达载体转化入目标物种中，构建得到所述抗青枯菌物种；

所述将抗青枯病的胞外核酸酶通过上述方法筛选得到。