[发明专利]一种用于快速检测沙门氏菌的扩增引物、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种快速检测沙门氏菌的引物、试剂盒及其应用，所述检测试剂盒由核酸快速扩增试剂和荧光免疫层析试纸、运行缓冲液组成。核酸快速扩增试剂包括含石墨烯的扩增缓冲液、沙门氏菌特异性扩增引物和质控品。所述荧光免疫层析试纸由样品垫、包被荧光微球抗体(抗DNA扩增产物一端标记物)偶联物的结合垫、包含检测线(抗DNA扩增产物另一端标记物)和控制线的NC膜、吸水纸以及PVC胶板组成。核酸快速扩增反应完成后加入运行缓冲液，混匀后滴加到试纸加样窗口，2min后使用荧光分析仪进行荧光信号判读。整个过程可在30min内完成。本发明沙门氏菌快速检测试剂盒，操作简便、快速、灵敏，结果可靠，有利于实际应用。

技术领域

本发明涉及一种用于快速检测沙门氏菌的扩增引物、试剂盒及其快速检测沙门氏菌的方法，属于分子生物学检测技术等技术领域。

背景技术

沙门氏菌是导致食物中毒及胃肠道感染最常见的革兰氏阴性菌之一，其包含超过2600种能够在多种宿主中引起感染的血清型。沙门氏菌的感染源主要包括牛奶、鸡蛋、肉类(家禽、牛肉)、蔬菜和新鲜水果，每年导致全球数以千万计的感染病例，造成巨大的经济和社会损失。此外，沙门氏菌也是动物饲料和宠物食品中的主要致病性微生物。这些饲料的安全性不仅关乎动物健康，同时也关乎动物源食品或处理宠物食品的人员健康。

为了减少与食品和饲料产品相关的沙门氏菌爆发和疾病，需要从农场到餐桌进行多环节的检测和控制。目前，沙门氏菌检测和鉴定的标准方法主要包括细菌分离和生化鉴定。基于培养法的细菌分离虽然结果可信度高，但操作程序复杂、耗时费力(通常需要5～7天)且在肠杆菌科下不同物种之间可发生交叉生化反应。以血清学检测为代表的免疫学方法简单快速，但灵敏度和特异性仍有待提高。且以聚合酶链反应(PCR)为代表的高灵敏度和特异性的核酸扩增方法已广泛应用于沙门氏菌等病原微生物的检测。然而，检测结果的判断主要依赖于传统的琼脂糖凝胶电泳检测，由于需使用含有毒性的核酸染料等试剂，实验安全性有待提高。实时荧光定量PCR技术等能够在不使用有毒试剂的情况下对靶标进行定量检测，但由于仪器和试剂成本较高而未能在基层和实际检验工作中广泛使用。因此，建立一种不需要昂贵的设备和试剂且适于沙门氏菌现场即时检测(Point-of-care testing，POCT)的分子分析方法对于有效防控沙门氏菌的传播具有极为重要的意义。

根据目前已公开的文献或专利中基于核酸的沙门氏菌检测技术包括常规PCR、荧光定量PCR、数字PCR、免疫PCR、等温扩增(如环介导等温扩增、重组酶聚合酶扩增等)及其衍生技术。这些方法均有着各自的局限性，如依赖存在安全威胁的琼脂糖凝胶电泳、操作要求严格、检测试剂和仪器成本高、引物设计要求高或引物需多次筛选等局限性。

近年来，以免疫反应为基础的胶体金试纸检测技术目前正逐步应用于核酸检测，如胶体金法等。此方法方便快捷，可实现比色判断，但扩增产物中潜在的引物二聚体、多聚体等复杂结构产物容易导致假阳性结果的产生。因此，有效解决扩增产物中复杂结构产物对扩增产物判断的干扰问题是试纸检测技术的关键之一。此外，为了更有利于实现病原体的早期检测，基于胶体金试纸的核酸检测技术的灵敏度也亟待提高。

因此，本领域亟需一种操作简单、灵敏快速、用户友好且结果可靠的沙门氏菌快速检测试剂盒及其非诊断性检测方法。

发明内容

发明目的：针对现有检测技术在检测沙门氏菌应用中存在的操作程序复杂、时间长、成本高、使用条件存在限制、不满足POCT要求等问题，本发明的第一目的是提供一种基于沙门氏菌基因组快速扩增的引物，本发明的第二目的是提供一种含有用于快速检测沙门氏菌的扩增引物的试剂盒，本发明的第三目的是提供一种利用该扩增引物或试剂盒快速检测沙门氏菌的方法。

技术方案：本发明所述一种用于快速检测沙门氏菌的扩增引物是基于基于沙门氏菌bcfC基因特异性保守区域设计，包括正向引物bcf-F和反向引物bcf-R，所述正向引物bcf-F序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物bcf-R序列如SEQ ID NO：2。