[发明专利]一种高通量测序筛选抗原特异性抗体Ig序列的方法

说明书

本发明提供一种高通量测序筛选抗原特异性抗体Ig序列的方法，涉及高通量筛选抗原特异性抗体的技术领域。所述高通量测序筛选抗原特异性抗体Ig序列的方法主要包括B细胞的扩增、相应抗原的体外刺激以获得抗原特异性BCR，通过单细胞BCR配对高通量测序获得相应抗原肽刺激的Ig序列，从而获得抗原特异性重链与轻链配对BCR，本发明抗原特异性筛选过程准确性高，速度快，能够对已知病原和未知病原进行处理，同时能够同步处理多种抗原获得其对应的Ig序列，提升筛选的便捷性，降低筛选成本。

技术领域

本发明涉及高通量筛选抗原特异性抗体的技术领域，具体涉及一种高通量测序筛选抗原特异性抗体Ig序列的方法。

背景技术

不同于其他药物开发，抗体药物在开发上存在天然挑战，即如何快速开发有效针对特异性抗原的中和抗体药物，这也是目前生物医药业行业所关注的本质问题。不管是多克隆抗体还是单克隆抗体或者是基因工程抗体的筛选，在技术上单次几十至几百的抗体筛选仍然处于低通量，与抗体谱的巨大数据相比，低通量技术只为我们揭示了抗体序列信息的冰山一角，而且获得序列信息包含大量非特异性的序列。目前抗体筛选的方法虽然有多种，但是仍需一种稳定，高效，高通量的抗体筛选方法。

随着高通量测序技术在抗体领域中的应用，使得一次测序可获得数以百万计的B细胞的抗体可变区域序列，越来越接近人体抗体谱真实数量，抗体的研究从而进入大数据时代。大容量和多样性好的抗体基因库是成功筛选功能抗体的基础。目前用于基因库筛选的所有展示技术均采用了一种表型选择压力的原理，即依赖于受体-配体的竞争结合力，这样的筛选过程一方面通过展示技术富集了目标抗体，另一方面可能导致筛选环节中的一些稀有分子、低结合力分子、可溶性表达量过低的分子或产量较低的抗体被漏筛。例如在筛选抗病毒的中和性抗体过程中，经常发现获得的高亲和力抗体没有较好的中和作用，这是因为获得的高亲和力抗体并不是针对中和作用的靶标，因而获得的抗体是不相关的抗体。而DNA测序过程没有选择压力，可以释放较完整的基因库的序列信息，有利于捕获目标基因。

目前通过测序来获得抗体库的方法：1.利用流式或微流控分选技术筛选出具有抗原结合功能的B淋巴细胞，然后进行高通量测序获得编码抗体的信息。未采用单细胞测序，因此在重链和轻链配对的过程中只能通过已有的大数据进行人工智能来预测配对情况，但是这个方法仅限于已有数据的抗体库，对于未知的抗原比如新冠，没有太多的抗体库可以作为参考，就需要大量的验证工作。2.在单细胞测序的应用下，可以获得B细胞的重链与轻链的配对信息。不管是在基于96孔或384孔的这种可自由设计的操作或成熟产品比如10x等单细胞制备仪器，都只能作为一个下游的单细胞测序应用中的一个工具，辅佐上游实验设计。

申请号为2021114340545的专利公开了“一种高通量筛选抗原特异性TCR的方法”，主要是一种高通量测序的方法，但是其技术特征为TCR的相关测序，通过T淋巴细胞具有细胞毒性作用，具有识别肿瘤细胞或异己细胞进行杀伤作用，因此可将抗原特异性TCR通过基因工程技术构建TCR-T用于细胞免疫治疗。该现有技术其并不能直接应用于抗体药的开发和相应的实验研究，而对于可识别抗原的免疫受体蛋白(Ig)的相应研究则可以将Ig受体作为抗体药物直接用于治疗相关疾病，比如新冠的中和抗体药的开发。

另外凭借目前的生物学知识，仍旧很难通过抗体的基因(或蛋白)序列来预测一个单克隆抗体的生物学性质，如结合的亲和力、是否中和能力或信号通路激活能力等，所以需要将所获得的抗体基因信息，进行基因合成并构建到相应的表达载体中进行小量表达纯化后，进行功能学上面的验证；这一步骤既耗时、又耗费，同时由于早期筛选中仍旧存在着一定的非特异性结合，有很大比例的抗体不能特异性结合对应的抗原或具有相应的生物学功能。