[发明专利]基因编辑系统及其在制备SCN5A基因突变的心率失常模型猪核移植供体细胞中的应用

权利要求书

1.一种制备重组猪细胞的方法，包括如下步骤：用SEQ ID NO：18所示的DNA分子取代猪细胞的染色体DNA中SEQ ID NO：19所示的DNA分子，得到重组猪细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：用SEQ ID NO：18所示的DNA分子取代猪细胞的染色体DNA中SEQ ID NO：19所示的DNA分子的实现方式为：将SCN5A-gRNA2、SCN5A-gRNA3、SCN5A-mutant-ss153和NCN蛋白共转染猪细胞；所述SCN5A-gRNA2为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：16中第3-22位核苷酸所示；所述SCN5A-gRNA3为sgRNA，其靶序列结合区如SEQID NO：17中第3-22位核苷酸所示；所述SCN5A-mutant-ss153为SEQ ID NO：18所示的单链DNA分子；所述NCN蛋白为Cas9蛋白或具有Cas9蛋白的融合蛋白。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述NCN蛋白如SEQ ID NO：3所示。

4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：猪细胞、SCN5A-gRNA2、SCN5A-gRNA3、SCN5A-mutant-ss153和NCN蛋白的配比依次为：10万个猪细胞：0.8-1.2μg SCN5A-gRNA2：0.8-1.2μg SCN5A-gRNA3：1.8-2.2μg SCN5A-mutant-ss153：3-5μg NCN蛋白。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：

所述NCN蛋白的制备方法包括如下步骤：

(1)将质粒pKG-GE4导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌；

(2)采用液体培养基30℃培养所述重组菌，然后加入IPTG并25℃诱导培养，然后收集菌体；

(3)将收集的菌体进行菌体破碎，收集粗蛋白溶液；

(4)采用亲和层析从所述粗蛋白溶液中纯化具有His₆标签的融合蛋白；

(5)采用具有His₆标签的肠激酶酶切具有His₆标签的融合蛋白，然后采用Ni-NTA树脂去除具有His₆标签的蛋白，得到纯化的NCN蛋白；

质粒pKG-GE4中具有SEQ ID NO：1中第5209-9852位核苷酸所示的融合基因。

6.一种试剂盒，包括SCN5A-gRNA2、SCN5A-gRNA3、SCN5A-mutant-ss153和NCN蛋白；

SCN5A-gRNA2为权利要求2中所述的SCN5A-gRNA2；SCN5A-gRNA3为权利要求2中所述的SCN5A-gRNA3；SCN5A-mutant-ss153为权利要求2中所述的SCN5A-mutant-ss153；NCN蛋白为权利要求2或3或5中所述的NCN蛋白；

所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组猪细胞；(b)制备心率失常模型猪；(c)制备心率失常细胞模型或心率失常组织模型或心率失常器官模型。

7.一种试剂盒，包括SCN5A-gRNA2、SCN5A-gRNA3、SCN5A-mutant-ss153和PRONCN蛋白；

SCN5A-gRNA2为权利要求2中所述的SCN5A-gRNA2；SCN5A-gRNA3为权利要求2中所述的SCN5A-gRNA3；SCN5A-mutant-ss153为权利要求2中所述的SCN5A-mutant-ss153；

所述PRONCN蛋白自上游至下游依次包括如下元件：信号肽、分子伴侣蛋白、蛋白标签、蛋白酶酶切位点、核定位信号、Cas9蛋白、核定位信号；

所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组猪细胞；(b)制备心率失常模型猪；(c)制备心率失常细胞模型或心率失常组织模型或心率失常器官模型。