[发明专利]基因编辑系统及其在制备SCN5A基因突变的心率失常模型猪核移植供体细胞中的应用

说明书

本发明公开了基因编辑系统及其在制备SCN5A基因突变的心率失常模型猪核移植供体细胞中的应用。本发明提供了一种制备重组细胞的方法：用SEQ ID NO：18所示的DNA分子取代猪细胞的染色体DNA中SEQ ID NO：19所示的DNA分子，得到重组猪细胞。本发明采用CRISPR/Cas9技术联合ssODN同源重组技术进行了SCN5A基因的的定向基因编辑，模拟心率失常的自然发病遗传特征，并获得了SCN5A基因定向突变的单细胞克隆，为后期通过体细胞核移植动物克隆技术培育心率失常模型猪奠定了基础。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及基因编辑系统及其在制备SCN5A基因突变的心率失常模型猪核移植供体细胞中的应用。

背景技术

心率失常是一种心肌收缩率的紊乱，或者是正常心跳节律或速率的任何变异。它包括规则或不规则的异常节律，以及节律的丧失。心律失常与离子通道基因表达异常明确相关，多个离子通道基因的突变可引起各种心律失常。目前，已知绝大多数的原发性心电异常都是由编码各主要离子通道亚单位的基因突变引起的，因此,这类病可称为“离子通道病”。Nav1.5通道是人类主要的心脏钠离子通道类型，负责动作电位的起始和传播，由SCN5A基因编码。

研究心率失常的发生发展机制及研发相应的药物均需要在动物模型的基础上进行，目前常用的动物模型为小鼠模型，在SCN5A基因敲除的小鼠中观察到了明显的心率失常，然而小鼠不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，不能真实地模拟人类正常的生理、病理状态。猪作为大动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。

基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。

同源重组(HDR)是通过序列同源性交换DNA序列信息：即修复模板中包含所需插入片段，修复模板的两端则是与插入位点附近具有序列同源性的重组臂。过去通常使用双链DNA(dsDNA)作为修复模板，但最近的研究揭示了单链寡核苷酸脱氧核苷酸(ssODN)作为HDR供体模板的优越性。首先，ssODN作为供体模板比dsDNA模板的插入位点特异性高，dsDNA模板容易产生随机插入。其次，ssODN对同源重组臂的长度要求比dsDNA模板更短，单侧30-60个碱基的重组臂设计可以获得高效且稳定的HDR，相比类似的dsDNA模板，其提供的插入效率更高。第三，dsDNA容易被NHEJ修复途径合并，从而导致同源臂的复制或者dsDNA模板的部分整合，而ssODN就不易产生这种现象。另外，dsDNAs对培养的细胞是有害的，线型或者质粒dsDNAs的转染效率较低，并使细胞产生不良反应，而ssODN模板在这些方面就更有优势。

发明内容

本发明的目的是提供基因编辑系统及其在制备SCN5A基因突变的心率失常模型猪核移植供体细胞中的应用。

本发明提供了一种制备重组猪细胞的方法，包括如下步骤：用SEQ ID NO：18所示的DNA分子取代猪细胞的染色体DNA中SEQ ID NO：19所示的DNA分子，得到重组猪细胞。

用SEQ ID NO：18所示的DNA分子取代猪细胞的染色体DNA中SEQ ID NO：19所示的DNA分子的实现方式为：将SCN5A-gRNA2、SCN5A-gRNA3、SCN5A-mutant-ss153和NCN蛋白共转染猪细胞。

猪细胞、SCN5A-gRNA2、SCN5A-gRNA3、SCN5A-mutant-ss153和NCN蛋白的配比依次为：10万个猪细胞：0.8-1.2μg SCN5A-gRNA2：0.8-1.2μg SCN5A-gRNA3：1.8-2.2μgSCN5A-mutant-ss153：3-5μg NCN蛋白。