[发明专利]一种替换PgsB来源的γ-PGA合成酶的基因簇及其合成聚谷氨酸的方法

说明书

本发明公开了一种替换PgsA来源的γ‑PGA合成酶的基因簇及其合成聚谷氨酸的方法，将地衣芽孢杆菌的γ‑聚谷氨酸合成酶基因簇pgsBCA克隆至一株高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌F343中进行外源表达，在此基础上，将pgsB替换为其他菌株来源的pgsB，分别是枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌，得到重组菌株B′(BS)CA、B′(BM)CA、B′(BAM)CA、B′(BAN)CA，其中B′(BS)CA、B′(BM)CA、B′(BAM)CA所生产的γ‑PGA产量分别提高了48.00％、107.87％和98.43％，而B′(BAM)CA所生产的γ‑PGA产量明显下降。因此替换特定的PgsBCA多蛋白复合体中PgsB的来源是进一步提高γ‑PGA产量的有效方法。

技术领域

本发明涉及合成生物学和发酵工程领域，具体是单独替换PgsBCA多蛋白复合体中PgsB的来源，促进γ-PGA的合成，尤其是一种替换PgsB来源的γ-PGA合成酶的基因簇及其合成聚谷氨酸的方法。

背景技术

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种由L-谷氨酸和D-谷氨酸单体聚合成的生物聚合物，具有水溶性高、良好的生物降解特性、较强的增稠能力等性质，对金属离子具有优异的吸收性和结合能力。近年来，γ-PGA广泛应用于食品、化妆品、生物医学、环境保护等领域。

目前，微生物发酵是生产商业γ-PGA的主要方法，因为它具有原料廉价，环境污染少，天然产物纯度高等优点。主要的γ-PGA生产菌株是芽孢杆菌属，根据生产过程中，是否需要额外添加谷氨酸作为前体，γ-PGA生产菌株可以分为两种类型，即谷氨酸依赖型菌株和谷氨酸非依赖型菌株。有学者先后选择E.coli和C.glutamicum为底盘细胞，通过异源表达γ-PGA合成酶，在无需谷氨酸添加的条件下成功实现了γ-PGA的合成，但其产量不高。如专利CN103146630A生产γ-聚谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及构建方法和用途，是以野生型C.glutamicum ATCC13869为出发菌株，转入含有γ-PGA合成酶复合体基因pgsBCA的重组表达质粒获得的工程菌。

目前，有学者提出了一些提高异源表达γ-PGA合成酶提高γ-PGA产量的方法，如专利CN113234764A一种γ-聚谷氨酸的异源表达方法提出，在C.glutamicum F343pZM1-capBCA菌株发酵培养过程中外源添加不同浓度的D-Glu，用于合成不同D/L单体比的γ-聚谷氨酸；又如专利CN112175982A一种γ-PGA聚合酶基因重组菌株及其构建方法与应用提出，在串联表达聚谷氨酸合成酶基因簇capBCA的基础上，利用基因表达调控元件分别单独调控单个基因的表达水平，构建单独调控聚合酶基因重组菌株。但这些方法的产量提升有限。

如何更为高效、简单得提高异源表达γ-PGA合成酶方法中γ-PGA产量的问题，成为本领域的重点研究方向，具有重要的市场价值和应用前景。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的上述缺陷，本发明提供一种替换PgsB来源的γ-PGA合成酶的基因簇及其合成聚谷氨酸的方法，通过以高产L-谷氨酸的谷氨酸棒杆菌为底盘微生物，外源表达来源于地衣芽孢杆菌中γ-聚谷氨酸合成酶基因簇pgsBCA，在此基础上单独替换pgsB的来源，得到新的γ-PGA合成酶的基因簇，用于促进γ-PGA的合成。

本发明的第一个目的是，提供一种γ-PGA合成酶的基因簇pgsB′CA，所述基因簇pgsB′CA中的合成酶基因pgsB′的序列为如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6所示的其中任意一种。

可选的，在本发明的一种实施方式中，所述合成酶基因pgsB′来源于枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌其中任意一种。