[发明专利]一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法

权利要求书

1.一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、取两环菌置于含有300ul去离子水的1.5ml离心管中，80℃水浴30分钟灭活，再12000rmp离心2分钟，去上清，加入150ulTE缓冲液，振荡悬浮菌沉淀，100℃水浴10分钟，超声15min、12000rmp离心2分钟取上清转至96孔板，进行DNA提取，最后-20℃保存备用；

S2、将VNTR12位点分为四组，进行多重PCR扩增，使用的引物为MIX1、MIX2、MIX3和MIX4，得到PCR产物；

S3、将PCR产物使用3500XL上机进行基因分析；

S4、根据基因分析结果对比H37RV标准菌株的串联重复数和扩增片段的大小计算待测菌株的相对应位点的串联重复数目，再根据VNTR分类数据，构建生成树MST或者NJ树。

2.根据权利要求1所述的一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法，其特征在于：步骤S1中所述离心管在80℃水浴30分钟灭活时离心管需拧紧盖防止加热时离心管爆开。

3.根据权利要求1所述的一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法，其特征在于：步骤S2中所述多重PCR扩增的反应程序如下：

A1、先在95℃下反应15min；

A2、在94℃下反应1min；

A3、在59℃下反应1min；

A4、在72℃下反应1min30s；

A5、重复A2-A4的步骤40个周期；

A6、在72℃下反应10min；

A7、在4℃保温。

4.根据权利要求1所述的一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法，其特征在于：所述MIX1的mix为6.25、enhancer为1、ETR-DF为0.5、ETR-DR为0.5、miru26F为0.5、miru26R为0.5、miru40F为0.5、miru40R为0.5、H2O为0.25和DNA为2，所述MIX1的ETR-D引物序列号为GCGCGAGAGCCCGAACTGC(FAM)和GCGCAGCAGAAACGCCAGC，MIX1的miru26引物序列号为TAGGTCTACCGTCGAAATCTGTGAC和CATAGGCGACCAGGCGAATAG(HEX)，MIX1的miru40R引物序列号为TAGGTCTACCGTCGAAATCTGTGAC和CATAGGCGACCAGGCGAATAG(HEX)。

5.根据权利要求4所述的一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法，其特征在于：所述MIX2的mix为6.25、enhancer为1、Miru10F为0.5、Miru10R为0.5、VNTR1955F为0.5、VNTR1955R为0.5、ETR-EF为0.25、ETR-ER为0.25、H2O为1.25和DNA为2，所述MIX2的Miru10引物序列号为GTTCTTGACCAACTGCAGTCGTCC和GCCACCTTGGTGATCAGCTACCT(FAM)，所述MIX2的VNTR1955引物序列号为AGATCCCAGTTGTCGTCGTC(HEX)和CAACATCGCCTGGTTCTGTA，所述MIX2的ETR-E引物序列号为ACTGATTGGCTTCATACGGCTTTA和GTGCCGACGTGGTCTTGAT(TAMRA)。

6.根据权利要求5所述的一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法，其特征在于：所述MIX3的mix为6.25、enhancer为0.5、VNTR42F为0.5、VNTR42R为0.5、MIRU39F为0.5、MIRU39R为0.5、ETR-AF为0.25、ETR-AR为0.25、H2O为1.25和DNA为2，所述MIX3的VNTR42引物序列号为CTTGGCCGGCATCAAGCGCATTATT和GGCAGCAGAGCCCGGGATTCTTC(FAM)，所述MIX3的MIRU39引物序列号为CGCATCGACAAACTGGAGCCAAAC和CGGAAACGTCTACGCCCCACACAT(HEX)，所述MIX3的ETR-A引物序列号为AAATCGGTCCCATCACCTTCTTAT(TAMRA)和CGAAGCCTGGGGTGCCCGCGATTT。