[发明专利]一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法

说明书

本发明公开了一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法，主要先进行DNA提取，再将VNTR12位点分为四组，进行多重PCR扩增，得到的PCR产物使用3500XL上机进行基因分析，最后计算待测菌株的相对应位点的串联重复数目，再根据VNTR分类数据，构建生成树MST或者NJ树，其中DNA提取时取两环菌置于含有300ul去离子水的1.5ml离心管中，80℃水浴30分钟灭活，再12000rmp离心2分钟，去上清，加入150ulTE缓冲液，振荡悬浮菌沉淀，100℃水浴10分钟，超声15min、12000rmp离心2分钟取上清转至96孔板，3500XL上机是以高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间迁移速度和分配系数不同进行高效快速分离的电泳新技术，替代了传统的琼脂凝胶电泳，分辨率高，灵敏度高，从而提高了菌株的分析质量。

技术领域

本发明属于结核分枝杆菌分型溯源技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法。

背景技术

结核分枝杆菌俗称结核杆菌，是引起结核病的病原体。该菌可侵犯全身各器官，但以引起肺结核最多见。结核病是一种古老的疾病，是细菌感染性疾病致死的首位原因。根据对H37Rv标准菌株基因组的分析，获得与人类微卫星样可变数目串联重复序列相对应的位点，大小在52-77bp之间，重复单位的数目可以通过对相应位点的PCR扩增获得。

在对标准菌株基因组分析时，通常采用琼脂凝胶电泳的方式对各组分之间菌体迁移速度和分配系数不同进行分离，但是，琼脂凝胶电泳的在分离时分辨率低、灵敏度低，从而降低菌珠的分析质量。因此，我们提出一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法来解决上述存在的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法，以解决上述背景技术中提出现有技术中不仅工作效率低下，而且浪费大量人力的问题。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法，包括如下步骤：

S1、取两环菌置于含有300ul去离子水的1.5ml离心管中，80℃水浴30分钟灭活，再12000rmp离心2分钟，去上清，加入150ulTE缓冲液，振荡悬浮菌沉淀，100℃水浴10分钟，超声15min、12000rmp离心2分钟取上清转至96孔板，进行DNA提取，最后-20℃保存备用；

S2、将VNTR12位点分为四组，进行多重PCR扩增，使用的引物为MIX1、MIX2、MIX3和MIX4，得到PCR产物；

S3、将PCR产物使用3500XL上机进行基因分析；

S4、根据基因分析结果对比H37RV标准菌株的串联重复数和扩增片段的大小计算待测菌株的相对应位点的串联重复数目，再根据VNTR分类数据，构建生成树MST或者NJ树。

优选的，步骤S1中所述离心管在80℃水浴30分钟灭活时离心管需拧紧盖防止加热时离心管爆开。

优选的，步骤S2中所述多重PCR扩增的反应程序如下：

A1、先在95℃下反应15min；

A2、在94℃下反应1min；

A3、在59℃下反应1min；

A4、在72℃下反应1min30s；

A5、重复A2-A4的步骤40个周期；

A6、在72℃下反应10min；

A7、在4℃保温。