[发明专利]活性重组hTET2蛋白的表达及纯化方法

权利要求书

1.一种活性重组hTET2蛋白，其序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种用于编码权利要求1所述的活性重组hTET2蛋白的基因，其序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种权利要求1所述的活性重组hTET2蛋白的表达及纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

合成权利要求2所述的用于编码权利要求1所述的重组hTET2蛋白的基因，插入到载体pcDNA3.1中，得重组质粒pcDNA3.1-hTET2；

将重组质粒pcDNA3.1-hTET2转入HEK293F细胞中，培养至细胞活率低于70％时收获细胞培养物；

对细胞进行超声裂解，离心，得上清液；

将上清液进行亲和层析，透析脱盐，得重组hTET2蛋白粗提纯产物；

将蛋白粗提纯物进一步进行离子交换层析，得重组hTET2蛋白精提纯产物；

重组hTET2蛋白精提纯产物透析，超滤浓缩，分装，即得。

4.根据权利要求3所述的重组hTET2蛋白的表达及纯化方法，其特征在于，所述超声裂解的工艺参数为：功率250W，时间5min，3s/3s，采用的破菌液组成为：50mM Tris-HCl pH7.5，300mM NaCl，0.1*cOmpleteTM Protease Inhibitor Cocktail，0.1mM AEBSF，1％Triton X-100。

5.根据权利要求3所述的重组hTET2蛋白的表达及纯化方法，其特征在于，所述亲和层析的工艺参数为：冲洗杂蛋白所采用的冲洗液为含300mM NaCl且pH为7.5的Tris-HCl缓冲液，洗脱目标蛋白的洗脱液为含300mM NaCl、0.1mg/mL合成多肽DYKDDDDK、0.1*cOmpleteTMProtease Inhibitor Cocktail、0.1mM AEBSF且pH为8.0的HEPES缓冲液；

透析脱盐采用的脱盐缓冲液为含50mM NaCl且pH为8.0的HEPES缓冲液。

6.权利要求3所述的重组hTET2蛋白的表达及纯化方法，其特征在于，所述离子交换层析的工艺步骤为：

采用含50mM NaCl、10％甘油且pH为8.0的HEPES缓冲液冲洗杂蛋白；

再分别采用Elution Buffer A、Elution Buffer B、Elution Buffer C依次洗脱，所述Elution Buffer A为含150mM NaCl、10％甘油且pH为8.0的HEPES缓冲液，所述ElutionBuffer B为含300mM NaCl、10％甘油且pH为8.0的HEPES缓冲液，所述Elution Buffer C为含500mM NaCl、10％甘油且pH为8.0的HEPES缓冲液，收集含目标蛋白的样品。

7.权利要求3所述的重组hTET2蛋白的表达及纯化方法，其特征在于，所述对重组hTET2蛋白精提纯产物透析的步骤，采用脱盐缓冲液为含200mM NaCl、50％Glycerol、1mM TCEP且pH为7.5的Tris-HCl缓冲液。

8.权利要求3所述的重组hTET2蛋白的表达及纯化方法，其特征在于，超滤浓缩采用30kDa超滤管，离心，浓缩至蛋白浓度为4mg/mL。

9.权利要求1所述的重组hTET2蛋白或者权利要求3至8任一项所述表达及纯化方法制备的重组hTET2蛋白在甲基化反应测序中的应用。