[发明专利]活性重组hTET2蛋白的表达及纯化方法

说明书

本发明提供一种活性重组hTET2蛋白的表达及纯化方法，通过选择编码hTET2蛋白的活性序列的基因，并在其N端添加一段编码多肽序列DYKDDDDK的基因。再将目的基因转移至HEK293细胞中异源表达出重组hTET2蛋白，通过超声破碎细胞，再经DYKDDDDK抗体偶联层析柱亲和纯化，可以得到经EM‑Seq法验证转化率达98％以上的活性hTET2蛋白。

技术领域

本发明涉及一种蛋白纯化工程技术领域，具体涉及一种高活性重组hTET2蛋白的表达及纯化方法。

背景技术

基因组甲基化不能通过常规的PCR检测出来。目前，主流的甲基化测序方法是基于亚硫酸氢盐(Bisulfite，BS)处理DNA之后而衍生的测序方法。亚硫酸氢盐测序(BS-Seq)可以将未甲基化的胞嘧啶(C)脱氨基生成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶不会被脱氨基，仍然为(5mC)。在后续的测序过程中，U会被检测为T，5mC被检测为C，将测序结果与未经亚硫酸盐处理的测序结果进行对比，即可得到甲基化的位点。但是BS-Seq也存在以下缺陷：(1)亚硫酸氢盐极具破坏性，会降解接触到的99％的底物，因此不适用于稀有的样品。(2)BS-Seq的方法不能区分5-甲基胞嘧啶(5mC)及其氧化产物5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)。

TET(Ten-Eleven-Translocation)蛋白是生物体内一种依赖于α-酮戊二酸和Fe2+发挥催化活性的双加氧酶，TET家族蛋白广泛分布于生命之树，包括异叶阿米巴鞭毛虫Naegleria gruberi。在人类和小鼠中，TET蛋白可以催化5-甲基胞嘧啶(5mC)依次氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)，5-甲酰基胞嘧啶(5-fC)，5-羧甲基胞嘧啶(5-caC)，5fC和5caC的碱基可以被胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)切除。TET蛋白是DNA去甲基化过程中一种重要的酶。TET蛋白的这一特性使其在肿瘤早筛基因组甲基化测序方面有着非常大的应用前景。

目前研究表明：人TET2蛋白(简称“hTET2”)全长2002个氨基酸残基，包括DSBH结构域、半胱氨酸富集(Cys-rich)结构域以及三个Zinc fingers。DSBH结构域可以结合α-酮戊二酸(α-Ketoglutaric acid)和Fe²⁺，对5mC进行氧化；半胱氨酸富集(Cys-rich)结构域可以帮助稳定DSBH和5mC的结构；三个Zinc fingers使DSBH和Cys-rich结构域相连。

然而，现有阶段获得的hTET2蛋白对基因组的去甲基化作用导致基因表达异常会对细胞存在毒害，使得高转化率活性hTET2蛋白的表达和纯化成为一大难题。

发明内容

基于此，有必要提供一种重组hTET2蛋白的表达纯化方法，能够获得较高转化率活性的hTET2蛋白，适用于5mC去甲基化反应的测序应用。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种活性重组hTET2蛋白，其序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种用于编码上述活性重组hTET2蛋白的基因，其序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明还提供一种活性重组hTET2蛋白的表达及纯化方法，包括如下步骤：合成上述重组hTET2蛋白的基因，插入到载体pcDNA3.1中，得重组质粒pcDNA3.1-hTET2；将重组质粒pcDNA3.1-hTET2转入HEK293F细胞中，培养至细胞活率低于70％时收获细胞培养物；对细胞进行超声裂解，离心，得上清液；将上清液进行亲和层析，透析脱盐，得重组hTET2蛋白粗提纯产物；将蛋白粗提纯物进一步进行离子交换层析，得重组hTET2蛋白精提纯产物；重组hTET2蛋白精提纯产物透析，超滤浓缩，分装，即得。