[发明专利]一种用于检测核酸的荧光定量PCR方法

权利要求书

1.一种检测核酸的荧光PCR方法，所述方法包括：

准备PCR反应体系，所述PCR反应体系包含：

(i)包含或怀疑包含靶序列的核酸样品；

(ii)核酸聚合酶或核酸聚合酶组合，所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合具有5’–3’聚合酶活性以及5’–3’的核酸外切酶活性；

(iii)用于扩增所述靶序列以产生扩增子的引物对，所述引物对包含至少一个封闭引物，所述封闭引物包含位于封闭引物3’端的封闭核苷酸，其中所述封闭核苷酸可以阻断所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合的延伸；

(iv)与靶序列或扩增子序列互补的探针，所述探针包含连接荧光基团的第一核苷酸和连接淬灭基团的第二核苷酸，其中所述荧光基团的荧光信号在所述第一核苷酸未从所述探针上水解时被所述淬灭基团淬灭，并且其中所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合能够在延伸的过程中将所述第一核苷酸从与靶序列或扩增子结合的所述探针上水解，从而使得所述荧光基团的荧光信号不被所述淬灭基团淬灭；和

(v)去封闭剂，所述去封闭剂能够在所述封闭核苷酸与所述靶序列或所述扩增子杂交时将所述封闭核苷酸从所述封闭引物上去除，使得所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合能够从所述封闭引物延伸；

将所述PCR反应体系在适当反应条件下进行扩增反应；和

检测所述PCR反应体系的荧光信号。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述封闭核苷酸是2',3'-双脱氧核苷酸、核糖核苷酸残基、2',3'SH核苷酸或2'-O-PO₃核苷酸。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合包含去封闭剂的功能。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合还具有焦磷酸酶活性。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合选自下组：(1)具有F762Y突变的E.coli DNA聚合酶I，(2)具有F667Y突变的Taq DNA聚合酶(Taq-F667Y)、以及(3)切除了N片段并具有F667Y突变的Taq DNA聚合酶(KlenTaq-s)与具有5’-3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶的组合。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述核酸聚合酶为经柠檬酸酐(CitraconicAnhydride)修饰的Taq-F667Y(Taq-F667Y/CA)。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述具有5’–3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶选自下组：Taq DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶、E.coli DNA聚合酶I。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述去封闭剂选自下组：具有F762Y突变的E.coliDNA聚合酶I、Taq-F667Y、Taq-F667Y/CA、KlenTaq-s、焦磷酸盐、三聚磷酸盐、RNase H2和CS5DNA聚合酶，其中所述CS5 DNA聚合酶具有选自G46E、L329A、Q601R、D640G、I669F、S671F、E678G的突变或这些突变的组合。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶序列包含突变核苷酸，所述封闭核苷酸与所述突变核苷酸互补。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针荧光基团选自下组：FAM、VIC、JOE、NED、TET、HEX、TAMRA、ROX、TEXASRED、CY3、CY5、CY5.5、和CY7。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针淬灭基团选自下组：BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、MGB和TAMARA。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述封闭引物还可能包含错配核苷酸，所述错配核苷酸在所述封闭引物与所述靶序列杂交时不与靶序列互补。