[发明专利]一种用于检测核酸的荧光定量PCR方法

说明书

本发明涉及一种用于检测核酸的荧光PCR方法。该方法通过结合引物激活聚合反应和特异性荧光标记‑探针，能够高选择性和高特异性的检测目标核酸。

相关申请的引用

本申请要求2022年7月13提交的中国申请202210828832.7的优先权。其公开内容在此参考并入。

技术领域

本公开涉及分子生物学领域，特别涉及聚合酶链式反应(polymerase chainreaction)扩增和核酸定量检测的方法。具体地，本公开涉及一种利用引物激活聚合结合荧光探针的定量PCR方法，例如焦磷酸解激活聚合反应(Pyrophosphorolysis activatedpolymerization,PAP)结合荧光探针的检测核酸的定量PCR方法。

背景技术

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)作为扩增特定的DNA片段的方法广泛地应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、基因克隆和DNA序列测定等各方面。常规PCR反应由于引物和模版DNA的互补有一定的容错性，导致在大量非靶序列DNA存在的情况下会产生非特异性扩增。因此，通常无法使用常规PCR反应检测有大量野生型DNA存在的样品中检测微量或少量突变型序列。

引物激活聚合反应是一类特殊的核酸扩增反应，可以在有强背景DNA存在的样品中精确检测模板DNA，为临床或科研领域检测低频突变或稀有突变提供了一种重要的检测手段。引物激活聚合反应体系中，使用了一类特异性修饰的封闭引物(比如引物3’末端双脱氧核苷酸修饰)，该封闭引物只有在与模板DNA链互补结合，在去封闭剂的作用下解封闭(激活)时，才能在聚合酶介导DNA链合成反应。因此，引物激活聚合反应需要引物精准识别模板被激活再触发聚合反应。与普通PCR相比，此类反应具有特异性修饰引物的高选择性和反应的高特异性两大特点，可以保证扩增产物不是由引物和背景DNA序列结合产生的，大大降低了反应的假阳性。

典型的引物激活聚合反应包括焦磷酸解激活聚合反应(Pyrophosphorolysisactivated polymerization,PAP)，该反应使用了3’末端双脱氧核苷酸修饰的封闭引物，在合适的反应体系下，利用DNA聚合酶的焦磷酸解反应串联聚合反应进行核酸扩增(Liu Q,Sommer SS,Biotechniques 2000,29:1072-1076,1078,1080)。封闭引物在无模板或与模板不互补状态下，其3’末端双脱氧核苷酸不能发生焦磷酸解去除封闭，引物不激活则无法进行后续的由DNA聚合酶介导的聚合反应。只有当封闭引物与模板互补时，在焦磷酸盐缓冲液条件下DNA聚合酶发生焦磷酸解反应解除引物3’末端封闭，依赖于DNA模板的DNA聚合酶才能沿着引物延伸发生聚合反应。与普通PCR相比，PAP技术使用3'末端双脱氧核苷酸修饰的封闭引物，利用DNA聚合酶的焦磷酸酶活性激活引物和DNA聚合酶的聚合活性进行聚合反应，焦磷酸解活性的特异性和聚合反应本身的特异性相互叠加形成了PAP反应的高选择性和无可比拟的高特异性。

PCR反应的扩增产物可以用荧光方法加以检测。目前用于检测核酸扩增的荧光方法可以分为两种主要类型：1)非特异性荧光标记-染料法(例如SYBR Green I)，和2)特异性荧光标记-探针法(例如探针)。在非特异性荧光标记-染料法中，PCR扩增时染料能够非特异性地嵌入双链DNA发出较强的荧光，但非特异性扩增或引物二聚体形成也能产生假信号，而且染料法不能用于多重PCR扩增区分多个靶核酸。特异性荧光标记-探针法利用Taq DNA聚合酶聚合延伸时，其5’–3’核酸外切酶活性水解结合在模板DNA上的探针，释放荧光基团而发出荧光，具有特异性高、灵敏度高和重复性好的特点，同时通过标记不同荧光基团的探针可以进行多重PCR区分多个靶核酸。