[发明专利]一种分离纯化流感病毒感染上皮细胞外泌体的方法

权利要求书

1.一种分离纯化流感病毒感染上皮细胞外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)收集流感病毒感染的样品，于4℃以2000×g离心30min，弃除底部的细胞碎片，收集细胞上清备用；

(2)将步骤(1)处理后的细胞上清做以下处理：

样本于4℃以300×g离心10min，除去死细胞，取上清；

样本于4℃以2,000×g离心10min，除去细胞碎片，取上清；

样本于4℃以10,000×g离心30min，除去其他杂质，取上清；

用0.22um膜过滤，除去细胞上清中大于0.22um的囊泡，取滤液；

滤液样本转移至超高速离心管中，于4℃以110,000×g离心90min，弃上清，收集管底的沉淀物即为外泌体粗品；

(3)用4℃预冷的10mL 1×PBS重悬外泌体粗品；重悬液于4℃以110,000×g离心90min，弃掉上清；用1×PBS重悬沉淀，分装，标记为流感病毒样本；-80℃保存；

(4)取400μl所得的流感病毒-exo样本与50μl CD9磁珠、CD63磁珠、CD81磁珠混合物于室温下共孵育，得到磁性包被的产物；

(5)将μMACS分选柱放置于与磁珠分选仪相连的μMACS分选架上，并在分选柱顶部加入100μL平衡缓冲液平衡柱子，后使用100μL分离缓冲液洗涤柱子，洗3次，注意下一次加入缓冲液前应该等上一次的液体排空；

(6)将磁性包被的产物加到的μMACS分选柱中，用200μL分离缓冲液洗涤，未结合磁珠的分离缓冲液会顺利流出分选柱，注意下一次加入缓冲液前应该等上一次的液体排空；

(7)将μMACS分选柱移出磁场，用150μL分离缓冲液洗脱即可得到纯化的外泌体，即去除流感病毒颗粒的外泌体。

2.根据权利要求1所述的一种分离纯化流感病毒感染上皮细胞外泌体的方法，其特征在于：所述样品为细胞培液、血浆或血清。

3.根据权利要求1所述的一种分离纯化流感病毒感染上皮细胞外泌体的方法，其特征在于：步骤(6)中所述分离缓冲液为含0.1％牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液。

4.根据权利要求1所述的一种分离纯化流感病毒感染上皮细胞外泌体的方法，其特征在于：步骤(4)中共孵育的时间为1h。