[发明专利]一种分离纯化流感病毒感染上皮细胞外泌体的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，提供一种分离纯化流感病毒感染上皮细胞外泌体的方法，具体为：将样品离心，弃除底部的细胞碎片，收集细胞上清备用；细胞上清做梯度离心处理；用0.22um膜过滤，滤液进行超高速离心管，收集管底的沉淀物；重悬沉淀物；采用免疫磁珠法纯化外泌体，即去除流感病毒颗粒的外泌体。本发明的方法结合了梯度离心以及免疫磁珠法，该方法操作步骤简单、易实施，所提取的外泌体含量较多，纯度较高，且不混有病毒粒子，有利于外泌体后续的功能研究。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种分离纯化流感病毒感染上皮细胞外泌体的方法。

背景技术

流感(Influenza)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。主要通过飞沫传播，呈现季节性流行趋势，感染范围包括禽类，人类和猪等许多物种。据统计，全世界平均每年有300～500万人感染，25～50万人死于流感，流感病毒感染仍是人类面临的主要公共卫生问题。研究表明，外泌体参与病毒感染细胞与免疫细胞间的“对话”，可在细胞间转移蛋白质、mRNA和miRNA等物质，在病毒感染细胞与免疫细胞之间的沟通中发挥重要作用，近年来外泌体与病毒的研究成为热点，外泌体的提取与纯化对于外泌体研究十分重要。

然而，目前关于流感病毒感染呼吸道上皮细胞外泌体的研究较少，外泌体粒径大小为40～150nm，而流感病毒粒径为80～120nm，存在重叠的部分，常用的超速离心法无法将外泌体和流感病毒粒子分开，从而影响后续的研究。因此如何有效分离纯化流感病毒感染细胞后的外泌体是外泌体功能研究中极为重要的问题。

发明内容

本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种分离纯化流感病毒感染上皮细胞外泌体的方法，采用本发明的方法可以去除外泌体中的流感病毒粒子，获得纯度高的外泌体。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种分离纯化流感病毒感染上皮细胞外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)收集流感病毒感染的样品，于4℃以2000×g离心30min，弃除底部的细胞碎片，收集细胞上清备用；

(2)将步骤(1)处理后的细胞上清做以下处理：

样本于4℃以300×g离心10min，除去死细胞，取上清；

样本于4℃以2,000×g离心10min，除去细胞碎片，取上清；

样本于4℃以10,000×g离心30min，除去其他杂质，取上清；

用0.22um膜过滤，除去细胞上清中大于0.22um的囊泡，取滤液；

滤液样本转移至超高速离心管中，于4℃以110,000×g离心90min，弃上清，收集管底的沉淀物即为外泌体粗品；

(3)用4℃预冷的10mL 1×PBS重悬外泌体粗品；重悬液于4℃以110,000×g离心90min，弃掉上清；用1×PBS重悬沉淀，分装，标记为流感病毒-exo样本；-80℃保存；

(4)取400μl所得的流感病毒-exo样本与50μl CD9磁珠、CD63磁珠、CD81磁珠混合物于室温下共孵育，得到磁性包被的产物；

(5)将μMACS分选柱放置于与磁珠分选仪相连的μMACS分选架上，并在分选柱顶部加入100μL平衡缓冲液平衡柱子，后使用100μL分离缓冲液洗涤柱子，洗3次，注意下一次加入缓冲液前应该等上一次的液体排空；

(6)将磁性包被的产物加到的μMACS分选柱中，用200μL分离缓冲液洗涤，洗4次，未结合磁珠的分离缓冲液会顺利流出分选柱，注意下一次加入缓冲液前应该等上一次的液体排空；

(7)将μMACS分选柱移出磁场，用150μL分离缓冲液洗脱即可得到纯化的外泌体，即去除流感病毒颗粒的外泌体。