[发明专利]一种鹅骨骼肌卫星细胞的体外分离和培养方法

权利要求书

1.一种鹅骨骼肌卫星细胞的体外分离和培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)消化：将清洗后的鹅的肌肉组织剪成肉糜状，加入消化工作液消化50min～60min；

(2)分离：加入含有3％胎牛血清的高糖DMEM培养基终止消化；充分分散消化液后，再将其依次用100μm的细胞筛和40μm的细胞筛过滤，离心，弃上层溶液；用红细胞裂解液重悬离心后得到的细胞，轻柔吹打多次，静置2～5min，再加入DPBS缓冲液，离心，弃上层溶液，收集沉淀；

(3)卫星细胞的培养：用鹅骨骼肌卫星细胞生长完全培养基重悬沉淀，轻柔吹打均匀后，转移至经基质胶包被后的培养皿中，用鹅骨骼肌卫星细胞生长完全培养基在培养箱中培养原代卫星细胞；

(4)差速贴壁纯化卫星细胞：原代卫星细胞在经基质胶包被后的培养皿中5～7天汇合度达到90％以上，进行传代；用胰酶消化后，收集细胞到离心管中，离心，收集沉淀，用鹅骨骼肌卫星细胞生长完全培养基重悬沉淀，再转移至未经基质胶包被处理的培养皿中，放入培养箱中静置45min～60min，吸取培养皿中上层培养基到新的经基质胶包被的培养皿中，十字混匀，放入培养箱中继续培养。

2.根据权利要求1所述的分离和培养鹅骨骼肌卫星细胞的方法，其特征在于步骤(1)所述的消化工作液中，每10mL消化工作液包含6.9mL高糖DMEM、1.5mL胶原酶Ⅱ储液、1.5mL的DispaseⅡ储液和0.1mL青霉素链霉素混合液。

3.根据权利要求2所述的分离和培养鹅骨骼肌卫星细胞的方法，其特征在于所述的Dispase II储液的制备是用50mL DPBS溶解1g Dispase II，充分溶解后用0.2μm的滤器过滤，-20℃储存；所述的胶原酶II储液的制备是用125mL DPBS溶解5g胶原酶II，充分溶解后用0.2μm的滤器过滤，-20℃储存。

4.根据权利要求1所述的分离和培养鹅骨骼肌卫星细胞的方法，其特征在于步骤(1)所述的清洗后的鹅的肌肉组织是在DPBS浸泡清洗3次。

5.根据权利要求1所述的分离和培养鹅骨骼肌卫星细胞的方法，其特征在于步骤(1)所述的每1cm³的肌肉组织用5～10mL消化工作液，消化的条件为37℃摇床上震荡。

6.根据权利要求1所述的分离和培养鹅骨骼肌卫星细胞的方法，其特征在于步骤(3)所述的鹅骨骼肌卫星细胞生长完全培养基为含有20％FBS并添加bFGF的DMEM/F12。

7.根据权利要求1所述的分离和培养鹅骨骼肌卫星细胞的方法，其特征在于步骤(3)所述的经基质胶包被后的培养皿的包被步骤如下：将基质胶包被液加入到培养皿中，能够覆盖培养皿底部，放入培养箱中静置3min以上，回收基质胶包被液。

8.根据权利要求7所述的分离和培养鹅骨骼肌卫星细胞的方法，其特征在于所述的鹅骨骼肌卫星细胞培养中采用的基质胶包被液的配制如下：将基质胶和高糖DMEM按照1:24的体积比例混合，4℃保存。

9.根据权利要求1所述的分离和培养鹅骨骼肌卫星细胞的方法，其特征在于步骤(2)和步骤(4)所述的离心条件为4℃，1500×g离心5～10min。

10.根据权利要求1所述的分离和培养鹅骨骼肌卫星细胞的方法，其特征在于步骤(2)所述的培养原代卫星细胞时，每两天添加部分新的鹅骨骼肌卫星细胞生长完全培养基。