[发明专利]一种鹅骨骼肌卫星细胞的体外分离和培养方法在审

专利信息
申请号: 202211057034.5 申请日: 2022-08-30
公开(公告)号: CN115181722A 公开(公告)日: 2022-10-14
发明(设计)人: 张力;杨东东;许加龙;朱善元 申请(专利权)人: 江苏农牧科技职业学院
主分类号: C12N5/077 分类号: C12N5/077
代理公司: 北京思创大成知识产权代理有限公司 11614 代理人: 高爽
地址: 225300 江*** 国省代码: 江苏;32
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摘要:
搜索关键词: 一种 骨骼肌 卫星 细胞 体外 分离 培养 方法
【说明书】:

发明公开了一种鹅骨骼肌卫星细胞的体外分离和培养方法,该鹅骨骼肌卫星细胞是通过体外分离、培养和纯化制备得到的;其中,鹅骨骼肌卫星细胞的分离包括消化、分离、卫星细胞的培养和差速贴壁纯化卫星细胞。本发明首次利用Dispase II和胶原酶II共同作用分散消化鹅骨骼肌,经过滤和红细胞裂解处理分离得到鹅骨骼肌卫星细胞。在体外培养过程中,利用含有20%FBS并添加bFGF的DMEM/F12生长完全培养基维持卫星细胞的分化潜能,并且培养过程中涉及的培养皿经基质胶特别包被处理。通过上述方法得到具有高度分化能力的鹅骨骼肌卫星细胞,经体外诱导分化,能形成成熟肌管且分化指数高达78%以上。

技术领域

本发明属于生物与新医药技术领域,具体涉及一种鹅骨骼肌卫星细胞的体外分离和培养方法,该方法得到的鹅骨骼肌卫星细胞具有高分化潜能。

背景技术

随着生活水平的提高,人们对家畜肉品质的要求也日益提高。鹅肉是理想的高蛋白、低脂肪和低胆固醇的营养食品,早在2002年,联合国粮农组织就将鹅肉列为21世纪重点发展的健康产品之一。在我国,鹅肉深受消费者喜青睐。因而开展鹅产肉性能品种改良,发掘鹅肌肉生长的功能基因,探究鹅骨骼肌生长发育调控的分子机理,开展鹅肌肉遗传育种的研究,具有重大的经济效应。

具有高分化潜能的鹅骨骼肌卫星细胞的获得是开展鹅肌肉组织生长发育调控机制研究的前提和基础。骨骼肌卫星细胞来源于肌刀中的一部分成肌祖细胞,位于肌膜和基底膜之间。这些细胞在出生后个体的肌肉组织中保留未分化状态,具有很强的分化潜能。早在1961年,科学家就通过电子显微镜观察青蛙骨骼肌肌纤维外围区域发现了肌源性卫星细胞(Mauro,1961)。1974年,Bischoff等首次从成年大鼠骨骼肌中分离出卫星细胞(Bischoff,1974)。之后,人们通过不断优化分离方法,逐渐分离出人类(Blau andWebster,1981),绵羊(Dodson et al.,1986),鸡(Bennett et al.,1986),牛(Dodson etal.,1987)等不同物种的卫星细胞。然而到目前为止,有关鹅骨骼肌卫星细胞分离培养及诱导分化的方法研究很少,且已有方法分离得到的卫星细胞分化能力有限(Wang et al.,2021)。因此本研究提供了一种新的体外分离鹅骨骼肌卫星细胞的方法,且实验证实,本发明分离得到的鹅骨骼肌卫星细胞具有高度分化的潜能,可以作为肌肉组织的体外诱导分化模型,为鹅肌肉组织的生长发育调控分子机制的研究提供了研究材料。

发明内容

本发明的目的是提供一种高分化潜能的分离和培养鹅骨骼肌卫星细胞及其分离和培养的方法。

本发明的目的是通过以下方式实现的:

一种鹅骨骼肌卫星细胞的体外分离和培养方法,该方法包括以下步骤:

(1)消化:将清洗后的鹅的肌肉组织剪成肉糜状,加入消化工作液消化50min~60min;

(2)分离:加入含有3%胎牛血清的高糖DMEM培养基终止消化;充分分散消化液后,再将其依次用100μm的细胞筛和40μm的细胞筛过滤,离心,弃上层溶液;用红细胞裂解液重悬离心后得到的细胞,轻柔吹打多次,静置2~5min,再加入DPBS缓冲液,离心,弃上层溶液,收集沉淀;

(3)卫星细胞的培养:用鹅骨骼肌卫星细胞生长完全培养基重悬沉淀,轻柔吹打均匀后,转移至经基质胶包被后的培养皿中,用鹅骨骼肌卫星细胞生长完全培养基在培养箱中培养原代卫星细胞;不换液,每两天添加部分新的鹅骨骼肌卫星细胞生长完全培养基;原代培养过程中,部分卫星细胞贴壁缓慢,若换液会损失部分卫星细胞;

(4)差速贴壁纯化卫星细胞:原代卫星细胞在经基质胶包被后的培养皿中5~7天汇合度达到90%以上,进行传代;用胰酶消化后,收集细胞到离心管中,离心,收集沉淀,用鹅骨骼肌卫星细胞生长完全培养基重悬沉淀,再转移至未经基质胶包被处理的培养皿中,放入培养箱中静置45min~60min,吸取培养皿中上层培养基到新的经基质胶包被的培养皿中,十字混匀,放入培养箱中继续培养。

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