[发明专利]一种基于双端测序重叠片段和DNA双链互补片段的超低频突变检测方法

权利要求书

1.一种基于双端测序重叠片段和DNA双链互补片段的超低频突变检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以不依赖于PCR扩增方法构建DNA文库，同时优化DNA文库制备条件，包括结合使用TE缓冲液、缩短片段化时间进行基因组DNA片段化和使用特异性酶进行末端修复；

(2)缩短文库片段长度产生双端测序重叠片段结合互补链信息，获得DNA模板的拷贝片段并进行测序错误校正，包括：缩短文库插入片段的长度至～150bp，通过Illumina测序的2×150bp双端测序模式获得双端测序重叠片段，用双链DNA模板互补链的一组拷贝片段获得非PCR来源的同一双链DNA模板来源的四条拷贝片段进行测序错误校正；

(3)选择内源性标签对拷贝片段进行标记；

(4)数据处理和突变分析，包括：

根据双端读段在基因组的比对信息进行同一模板来源的拷贝片段提取：互补链来源的双端读段在基因组上的比对位置相同、比对方向相反；

对提取的拷贝片段进行序列信息比对：当同一位点存在不一致碱基时，提示存在测序错误，则该位点被剔除；当且仅当同一位点序列信息一致，保留一致的碱基信息用于突变分析。

2.根据权利要求1所述基于双端测序重叠片段和DNA双链互补片段的超低频突变检测方法，其特征在于，适用于包括人类基因组和小鼠基因组的哺乳动物全基因组，测序深度≤40×。

3.根据权利要求1所述基于双端测序重叠片段和DNA双链互补片段的超低频突变检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述TE缓冲液的组成为10mM Tris-HCl,1mM EDTA-Na₂，pH8.0。

4.根据权利要求1所述基于双端测序重叠片段和DNA双链互补片段的超低频突变检测方法，其特征在于，步骤(1)中，用Covaris Focused-ultrasonicator S220非接触式超声波破碎仪片段化的条件为：最大发射功率为175W，工作系数为10％，循环数为200，水位为12，片段化时间为140s，温度为7℃。

5.根据权利要求1所述基于双端测序重叠片段和DNA双链互补片段的超低频突变检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述特异性酶选自单链特异性核酸酶、DNA损伤修复酶或DNA聚合酶，所述单链特异性核酸酶包括S1核酸酶，所述DNA损伤修复酶包括Fpg酶，所述末端修复酶包括T4 DNA聚合酶。

6.根据权利要求1所述基于双端测序重叠片段和DNA双链互补片段的超低频突变检测方法，其特征在于，步骤(4)中，剔除分布于插入片段末端10bp区域内的碱基信息。

7.根据权利要求1所述基于双端测序重叠片段和DNA双链互补片段的超低频突变检测方法，其特征在于，步骤(4)中，还包括给出提取拷贝片段、一致性碱基和突变分析过程的步骤。

8.根据权利要求1所述基于双端测序重叠片段和DNA双链互补片段的超低频突变检测方法，其特征在于，步骤(4)中，还包括结合基于单链的一致性分析方法对测序过程中的错误来源进行系统分析的步骤。

9.权利要求1-8任一项所述基于双端测序重叠片段和DNA双链互补片段的超低频突变检测方法在哺乳动物全基因组超低频突变检测中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物基因组包括人类基因组和小鼠基因组。