[发明专利]一种基于双端测序重叠片段和DNA双链互补片段的超低频突变检测方法

说明书

本发明公开了一种基于双端测序重叠片段和DNA双链互补片段的超低频突变检测方法，包括选择不依赖于PCR扩增的方法构建DNA文库，结合使用TE缓冲液、缩短片段化时间进行基因组DNA片段化和使用特异性酶末端修复减少测序错误，缩短文库片段长度产生双端测序重叠片段结合互补链信息获得DNA模板的拷贝片段进行测序错误校正，选择内源性标签对拷贝片段进行标记，根据互补链来源的双端读段在基因组上比对位置相同、比对方向相反提取拷贝片段，进行序列信息比对，保留一致的碱基信息用于突变分析。本发明构建的测序方法有效降低NGS突变检测的错误率，针对哺乳动物全基因组实现高准确性、低测序成本的超低频突变检测。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于双端测序重叠片段和DNA双链互补片段的超低频突变检测方法。

背景技术

DNA测序是识别基因组序列信息、解决大量生命科学领域问题的关键手段。自2005年以来，第二代测序技术(Next-generation sequencing，NGS)以Illumina Solexa和HiSeq技术、Roche 454技术、ABI SOLiD技术以及Life Technologies Ion Torrent等技术为代表，逐步实现了自动化的高通量测序，使得低成本的大规模基因组变异检测成为可能。经过近十几年的不断发展，NGS以其高通量和低成本，已然成为目前生命科学研究的常规技术手段，广泛应用于肿瘤研究、宏基因组学分析、进化研究和产前诊断等诸多领域。

然而，NGS的随机测序错误率很高，约为10^-3-10^-2；也就是说，平均每测序10²-10³个碱基，就会有1个碱基被错误地识别为其他碱基。遗传于父母的胚系突变及生命早期的体细胞突变会存在于绝大多数体细胞中，NGS的高错误率并不会影响对此类突变的检测。在肿瘤组织等样本中，由于存在细胞的克隆性增殖，相同突变会在同一个克隆来源的细胞群中存在；当这些突变的比例(即，变异等位基因频率)大于1％时，随机测序错误的影响可以被忽略，通过提高NGS测序深度也能够获得比较准确的突变信息(真实的变异等位基因频率＞～1％＞随机测序错误产生的变异等位基因频率)。而在正常组织细胞中，自发突变的发生率很低。以人类基因组为例，细胞每分裂一次碱基发生突变的概率约为10^-9-10^-8。同时，绝大多数自发突变并不会引起细胞表型和功能的改变，携带有这些突变的细胞其扩增往往是有限的。因此，在正常的组织细胞中，突变发生率低并且其变异等位基因频率通常远低于1％，属于“超低频突变”。此时，在常规NGS 10^-3-10^-2的测序错误率的条件下，难以对上述超低频突变进行准确的检测。

目前，有几种基于NGS的策略或技术被应用于超低频突变的检测，包括：(1)单细胞测序技术(分离单个细胞，进行全基因组扩增并测序)；(2)体外培养单克隆来源的细胞利用NGS进行突变检测；(3)使用微量组织(含有较高比例的克隆性增殖的细胞群)或者利用显微技术根据组织结构分离单克隆来源的细胞群进行突变检测以及(4)分子一致性测序(Molecular consensus sequencing)策略。前面三种方法主要是利用单细胞来源的序列信息(扩增片段或者单克隆来源的细胞)进行超低频突变检测。而分子一致性测序策略则是通过直接降低NGS进行碱基识别的错误率，实现对基因组片段进行直接的突变检测；其更适用于群体细胞的突变检测，以了解整体水平上的突变情形。