[发明专利]一种降低回复突变频率的重组5型腺病毒载体及其构建方法

权利要求书

1.一种降低回复突变频率的重组5型腺病毒载体，其特征在于：所述降低回复突变频率的重组5型腺病毒载体由如下方法制备得到：通过敲除人5型腺病毒的E1B区基因，且敲除至第4090碱基处，将5型腺病毒和HEK293基因组DNA之间的同源序列长度缩短至254bp，被删除的E1区基因片段中包括编码pⅨ的序列Ad5 3551-4070；然后将编码pIX的序列Ad5 3551-4070反向插入在E4区，即Ad5 35771处。

2.制备权利要求1所述的降低回复突变频率的重组5型腺病毒载体的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)构建左侧质粒：保留左侧端末端重复序列(ITR)和E1A区，删除E1B区，包括编码pIX的序列，在原本E1B区位置插入外源基因，保留5型腺病毒4091-5196序列；

(2)构建右侧质粒：保留除了E3区的其余腺病毒基因组，保留E3区中编码腺病毒死亡蛋白ADP的序列，在E4区反向插入编码pIX的序列；

(3)病毒包装：左侧质粒和右侧质粒分别使用限制性内切酶Pac I进行线性化，37℃酶切30-60min；后续65℃孵育30-60min使限制性内切酶Pac I失活；用PEI转染试剂使线性化的质粒在HEK293细胞聚合度为80％-90％时进行共转染，转染后10-14天HEK293细胞出现病变效应，超过50％细胞从培养瓶底部脱落；此时收集细胞悬液，冻融三次后3000rpm离心5-10min收集上清，得到重组病毒悬液。

3.根据权利要求2所述的制备降低回复突变频率的重组5型腺病毒载体的方法，其特征在于：步骤(1)中构建左侧质粒的具体方法为：以pfg140为模板扩增Ad5 1-1668片段，以pBHG10为模板扩增Ad5 4091-5196片段，中间插入CMV-hGM-CSF-SV40片段作为连接，将片段连接到pGEM-7Zf(+)载体上，构建出pGEM-7Zf(+)-Ad5(1-1668)-CMV-hGM-CSF-SV40-Ad5(4091-5196)质粒，即左侧质粒。

4.根据权利要求2所述的制备降低回复突变频率的重组5型腺病毒载体的方法，其特征在于：步骤(2)中构建右侧质粒的具体方法为：以质粒pBHG10为模板扩增Ad53551-4070片段；以质粒pBHG10为模板扩增pBHG10 2682-2866和pBHG10 5612-7286片段，以质粒pFG140为模板扩增Ad5 29485-29771，以pBHG10为模板扩增pBHG1026924-547；将扩增片段pBHG102682-2866、pBHG10 5612-7286、Ad5 29485-29771和pBHG10 26924-547插入pBHG10载体，然后反向插入Ad5 3551-4070扩增片段，得到完整右侧质粒。

5.根据权利要求4所述的制备降低回复突变频率的重组5型腺病毒载体的方法，其特征在于：所述扩增片段pBHG10 5612-7286和Ad5 4091-5196片段为同源序列，后续进行转染时在此发生同源重组。

6.根据权利要求4所述的制备降低回复突变频率的重组5型腺病毒载体的方法，其特征在于：所述扩增片段Ad5 29485-29771编码腺病毒死亡蛋白ADP。