[发明专利]一种降低回复突变频率的重组5型腺病毒载体及其构建方法

说明书

本发明属生物工程技术领域，为降低重组腺病毒与宿主细胞发生同源重组的概率，提供了一种降低回复突变频率的重组5型腺病毒载体及其构建方法。通过敲除人5型腺病毒的E1B区基因，且敲除至第4090碱基处，将5型腺病毒和HEK293基因组DNA之间的同源序列长度缩短至254bp，被删除的E1区基因片段中包括编码pⅨ的序列Ad5 3551‑4070；然后将编码pIX的序列Ad5 3551‑4070反向插入在E4区，即Ad5 35771处。重组腺病毒在包装和扩增时发生同源重组的频率降低，从而降低产生RCA的频率。既避免了重组腺病毒载体和HEK293细胞基因组DNA发生反向同源重组，又保证了重组腺病毒颗粒结构的稳定。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种降低回复突变频率的重组5型腺病毒载体及其构建方法。

背景技术

基因治疗是将外源正常基因或者具有治疗效果的基因通过一定的方式导入至人体靶细胞中，以纠正或补偿缺陷和异常基因，达到治疗的目的。近些年来重组腺病毒载体在基因治疗方面发挥了巨大的作用。重组腺病毒载体具有可以在培养中重组，较高的转基因插入能力等特点，在恶性肿瘤、中枢神经系统疾病、遗传病等都有重要应用。

虽然重组腺病毒载体有着广泛应用，但是也存在潜在的危险性。在重组腺病毒的生产过程中，重组腺病毒有概率会与宿主细胞发生同源重组，即发生回复突变(RCA)。回复突变不但会导致外源正常基因或者具有治疗效果的基因丢失，而且会产生具有复制能力的腺病毒，会对人体产生潜在的副作用。各国监管部门对使用重组腺病毒载体的基因治疗药物的回复突变的比例提出了非常高的要求，如美国食品药品监督管理局(FDA)要求在3×1010个拷贝的腺病毒颗粒中不超过1个拷贝的回复突变。因此构建一种可以降低回复突变频率的重组腺病毒载体是至关重要的。

发明内容

本发明为了降低重组腺病毒与宿主细胞发生同源重组的概率，提供了一种降低回复突变频率的重组5型腺病毒载体及其构建方法。

本发明由如下技术方案实现的：一种降低回复突变频率的重组5型腺病毒载体，所述降低回复突变频率的重组5型腺病毒载体由如下方法制备得到：通过敲除人5型腺病毒的E1B区基因，且敲除至第4090碱基处，将5型腺病毒和HEK293基因组DNA之间的同源序列长度缩短至254bp，被删除的E1区基因片段中包括编码pⅨ的序列Ad5 3551-4070；然后将编码pIX的序列Ad5 3551-4070反向插入在E4区，即Ad5 35771处。

制备所述的降低回复突变频率的重组5型腺病毒载体的方法，包括如下步骤：

(1)构建左侧质粒：保留左侧端末端重复序列(ITR)和E1A区，删除E1B区，包括编码pIX的序列，在原本E1B区位置插入外源基因，保留5型腺病毒4091-5196序列；

(2)构建右侧质粒：保留除了E3区的其余腺病毒基因组，保留E3区中编码腺病毒死亡蛋白ADP的序列，在E4区反向插入编码pIX的序列；

(3)病毒包装：左侧质粒和右侧质粒分别使用限制性内切酶Pac I进行线性化，37℃酶切30-60min；后续65℃孵育30-60min使限制性内切酶Pac I失活；用PEI转染试剂使线性化的质粒在HEK293细胞聚合度为80％-90％时进行共转染，转染后10-14天HEK293细胞出现病变效应，超过50％细胞从培养瓶底部脱落；此时收集细胞悬液，冻融三次后3000rpm离心5-10min收集上清，得到重组病毒悬液。

步骤(1)中构建左侧质粒的具体方法为：以pfg140为模板扩增Ad5 1-1668片段，以pBHG10为模板扩增Ad5 4091-5196片段，中间插入CMV-hGM-CSF-SV40片段作为连接，将片段连接到pGEM-7Zf(+)载体上，构建出pGEM-7Zf(+)-Ad5(1-1668)-CMV-hGM-CSF-SV40-Ad5(4091-5196)质粒，即左侧质粒。