[发明专利]一种检测ASFV抗体的重组蛋白、双抗原夹心ELISA试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种检测ASFV抗体的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白以ASFV p54和p30为抗原，所述重组蛋白序列如SEQ ID No.1所示，ASFV抗原氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的检测ASFV抗体的重组蛋白的制备方法，其特征在于，在p54和p30基因两端分别引入限制性酶切位点NdeI和XhoI，合成后插入载体pUC57中。

3.一种检测ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的检测ASFV抗体的重组蛋白、酶标板、HRP标记的抗GST酶标抗体、ASF阳性对照血清、ASF阴性对照血清、稀释液、反应液、10×洗涤液、TMB底物溶液和终止液。

4.如权利要求3所述的一种检测ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包被96孔酶标板的抗原为携带His标签的重组ASFV p54、p30重组蛋白p54-30-His；所述反应液为携带GST标签的重组ASFV p54、p30重组蛋白GST-p54-30。

5.如权利要求4所述的一种检测ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述的重组蛋白p54-30-His为利用装载有权利要求1所述的重组蛋白的质粒pET-30a(+)在BL21(DE3)大肠杆菌中表达、纯化获得；所述重组蛋白GST-p54-30为利用装载有权利要求1所述的重组蛋白的质粒pGEX-6P-1在BL21(DE3)大肠杆菌中表达、纯化获得。

6.如权利要求3所述的一种检测ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述的HRP标记的抗GST酶标抗体为HRP标记的小鼠源抗GST单克隆抗体；所述的ASF阳性对照血清为重组p54、p30融合蛋白免疫猪制备的血清；所述的ASF阴性对照血清为健康猪血清。

7.如权利要求3所述的一种检测ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒，其特征在于，

所述稀释液为含0.01％Proclin300的5％小牛血清；

所述10×洗涤液为：NaCl 80g，KCl 2g，Na₂HPO₄ 14.4g，KH₂PO₄ 2.4g，Tween-20 0.5mL，Proclin300 0.1mL，溶于800mL蒸馏水，调pH7.4，定容至1L，0.22μm滤器过滤除菌，4℃保存；

所述终止液为2M H₂SO₄。

8.权利要求3-7中任意一项所述的检测ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

重组蛋白p54-30-His、GST-p54-30制备；

ASF阳性对照血清、ASF阴性对照血清的制备；

检测ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒的制备。

9.如权利要求8所述的一种检测ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，检测ASFV抗体的重组蛋白采用的扩增引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

10.权利要求1所述的重组蛋白和权利要求3所述的试剂盒在制备非洲猪瘟病毒抗体检测的试剂中的应用。