[发明专利]一种检测ASFV抗体的重组蛋白、双抗原夹心ELISA试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的重组蛋白、双抗原夹心ELISA试剂盒及其应用，包括包被抗原的酶标板、酶标抗体、非洲猪瘟阳性对照血清、ASF阴性对照血清、稀释液、反应液、10×洗涤液、TMB底物溶液、终止液。该试剂盒中包被酶标板的抗原为携带His标签的重组ASFV p54、p30融合蛋白(p54‑30‑His)。该试剂盒可用于ASFV感染血清学诊断以及抗体的水平的监测、流行病学调查等，并能有效避免重组亚单位疫苗或病毒样颗粒疫苗免疫猪抗体检测时标签蛋白的干扰，为ASFV抗体检测、检测提供一种准确、有效的方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测ASFV抗体的重组蛋白、双抗原夹心ELISA试剂盒及其应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)引起家猪或野猪的一种高度接触性、热性传染病，高致病性毒株可造成感染猪100％死亡。

ASF目前现有的诊断技术主要包括三大类：核酸检测、抗原检测和抗体检测。强毒株常引起猪急性死亡，抗体检测难度；中、低毒力毒株感染后，因病程较长，能刺激机体产生较好的体液免疫应答，抗体检测是有效的诊断方法之一，OIE也明确指出，康复猪或感染持续一段时间的猪体内有ASFV抗体，可通过抗体检测来确诊是否感染过ASFV。

ASFV抗体检测方法主要以ELISA为主，有间接ELISA、阻断ELISA/竞争ELISA等。间接ELISA包被的往往是重组抗原，检测灵敏度较高，试剂盒制备相对简单，但在重组抗原纯化时使用了融合性标签蛋白(如His标签)，而临床上猪使用的病毒样颗粒(VLPs)亚单位疫苗在制备时，也常使用His标签纯化抗原，多次免疫后导致正常猪体内有一定水平的标签蛋白抗体，尽管在检测时血清做了大量稀释，但还是较容易出现检测结果的假阳性；阻断ELISA/竞争ELISA需要使用酶标记的特异性的抗体，猪血清中的ASFV抗体与酶标板上的抗原结合，阻断酶标抗体吸附，通过底物溶液显色确定结果的阴阳性，该方法虽然能降低检测结果的假阳性率，但需要合适、有效的单克隆抗体来提高反应的特异性与稳定性。

发明内容

为了实现上述发明目的，本发明以重组蛋白p54-30-His包被酶标板，通过抗原抗体反应吸附待检样品种的抗ASFV p54、p30抗体，加入反应液，间接吸附的抗体与重组蛋白GST-p54-30，利用HRP标记的抗GST酶标抗体结合吸附在酶标板上的GST抗原，底物溶液显色后，与临界值进行比较，判定待检样品中是否存在ASFV抗体，基于此原理建立、组装成检测ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒。该试剂盒可用于ASFV感染血清学诊断以及抗体的水平的监测、流行病学调查等，并能有效避免重组亚单位疫苗或病毒样颗粒(VLPs)疫苗免疫猪抗体检测时标签蛋白的干扰，为ASFV抗体检测、检测提供一种准确、有效的方法。

本发明采用的技术方案为：

一种检测ASFV抗体的重组蛋白，所述重组蛋白以ASFV p54和p30为抗原，所述重组蛋白序列如SEQ ID No.1所示，ASFV抗原氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供上述检测ASFV抗体的重组蛋白的制备方法，在p54和p30基因两端分别引入限制性酶切位点NdeI和XhoI，合成后插入载体pUC57中。

一种检测ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒，其特征在于，包括上述检测ASFV抗体的重组蛋白、酶标板、HRP标记的抗GST酶抗体、ASF阳性对照血清、ASF阴性对照血清、稀释液、反应液、10×洗涤液、TMB底物溶液、终止液。

进一步的，所述的试剂盒中包被96孔酶标板的抗原为携带His标签的重组ASFVp54、p30重组蛋白p54-30-His；所述反应液为工作浓度的携带GST标签的重组ASFV p54、p30重组蛋白GST-p54-30。