[发明专利]一种高效分泌有机磷农药水解酶MPH的基因工程枯草芽孢杆菌

说明书

有机磷农药降解酶MPH在去除有机磷农药残留方面有很好的应用潜力，但该酶还未实现高效生产。鉴于此，本发明将来源于菌株Pseudomonas sp.M6的MPH编码基因(mpd)进行密码子优化，然后将优化后的基因连同其他表达元件整合到枯草芽孢杆菌的染色体上，构建了高效合成MPH的基因工程菌。该工程菌无任何抗生素抗性基因残留，且合成的MPH被分泌至细胞外，产量达工业生产标准。

技术领域

本发明属于生物高技术领域，公开了一种用于高效表达有机磷农药水解酶MPH的基因工程枯草芽孢杆菌。

背景技术

瓜果蔬菜上的农药残留问题备受关注。有机磷农药是果蔬上常用的一类农药，包括毒死蜱、甲胺磷；甲基对硫磷和马拉硫磷等多个品种，是目前用量最大的杀虫剂种类。有机磷农药作用机理是抑制胆碱酯酶活性，对昆虫和人类都有较高毒性。虽然一些有机磷农药被禁用或限用，但是仍存在不当使用的情况，导致残留问题和中毒事故频发。

有机磷农药降解酶可高效分解有机磷农药，解除其毒性。此外，降解酶本质上是一种蛋白质，对人体无害。因此，有机磷农药降解酶被开发成洗涤产品，用于去除瓜果蔬菜上的有机磷农药残留。然而，现有产品中所用的降解酶依然存在活性不高和底物谱不广等问题，需要开发性能更好的降解酶品种。

目前已报道的有机磷农药水解酶有5种以上(Singh et al..2008.NatureReviews Microbiology.https://doi:10.1038/nrmicro2050)，其中MPH是我国首次发现的一种新型高效有机磷农药水解酶，该酶能降解甲基对硫磷、甲胺磷、辛硫磷、杀螟硫磷和毒死蜱的等多种有机磷农药，在去除有机磷农药残留方面有很好的应用潜力(Cui etal..2001.Applied and Environmental Microbiology.https://doi:10.1128/AEM.67.10.4922-4925.)。高效生产MPH是开发降解酶产品的前提之一。虽然研究者尝试在不同宿主中表达MPH，但依然存在宿主安全级别不高、工程菌稳定性差和抗性基因残留等问题，且已报道的产量(0.3mg/ml,Zhou et al..2019.Microbial Cell Factories.https://doi:10.1186/s12934-019-1159-0)远未达到工业生产标准(一般1mg/ml)。枯草芽孢杆菌是一种食品级的蛋白生产宿主，具备将外源蛋白高效分泌至胞外的能力。本发明利用基因工程手段构建一株能够高效合成MPH的枯草芽孢杆菌，该菌株不携带任何抗性基因残留，且MPH的产量达工业生产标准。

发明内容

虽然MPH在去除有机磷农药残留方面有很好的应用潜力，但该酶还未实现高效生产。鉴于此，本发明的目的是提供一个用于在枯草芽孢杆菌中高效表达有机磷农药水解酶MPH的表达盒和基因片段。

本发明的另一目的是提供该表达盒和基因片段的应用。

本发明的又一目的是提供一种高效分泌有机磷农药水解酶MPH的基因工程枯草芽孢杆菌。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种用于在枯草芽孢杆菌中高效表达有机磷农药水解酶MPH的表达盒，序列如SEQID NO.1所示。

本发明所述的表达盒在构建高效分泌有机磷农药水解酶MPH的基因工程枯草芽孢杆菌中的应用。

本发明所述的表达盒在制备有机磷农药水解酶MPH中的应用。

一种含本发明所述的表达盒的基因片段，序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明所述的基因片段在构建高效分泌有机磷农药水解酶MPH的基因工程枯草芽孢杆菌中的应用。

本发明所述的基因片段在制备有机磷农药水解酶MPH中的应用。

一种构建高效表达有机磷农药水解酶MPH且无抗生素抗性基因的枯草芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：