[发明专利]靶向TP53基因的sgRNA及其应用

说明书

本发明涉及靶向TP53基因的sgRNA及其应用，属于生物技术领域。本发明提供的靶向敲除TP53基因的sgRNA，其为TP53‑sgRNA 2‑7和TP53‑sgRNA 5‑8。本发明还提供一种食蟹猴TP53基因敲除的方法，该基因敲除方法敲除食蟹猴TP53基因，为建立非人灵长类肿瘤动物模型提供新的有效方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及靶向TP53基因的sgRNA及其应用。

背景技术

TP53基因是一种重要的抑癌基因，其编码的P53蛋白有五个功能域：分别是转录激活功能域(TAD)、富含脯氨酸功能域(PRD)、DNA结合功能域(DBD)、寡聚功能域(TD)、羧基端调控区(CTD)。控制着调控细胞周期、DNA修复和细胞凋亡的基因表达，在维持和保护基因组稳定性有关键作用。TP53基因的缺失或突变与肿瘤有关联，TP53突变影响其蛋白质结构、折叠和稳定性，从而影响其DNA结合能力和生理活性，TP53基因突变导致其肿瘤抑制功能失去或促进肿瘤的发生发展，在人类中约50％的肿瘤中存在TP53基因缺失或者突变，如肝癌、大肠癌、乳腺癌、口咽癌、卵巢癌、前列腺癌、白血病等。同时TP53突变也是人类遗传病李弗梅尼综合征(Li-Fraumeni syndrome，LFS)的发病原因，LFS的特征是发生一系列的早发性癌症，包括肺癌、胰腺癌、白血病等。在肿瘤细胞中约70％TP53的突变为错义突变，错义突变常发生在DNA结合域(DBD)里，DBD里每个密码子都发现TP53突变，但突变主要落在6个突变热点内，分别是氨基酸残基R175、G245、R248、R249、R273和R282，即热点突变主要在第5、7、8外显子上。

因此TP53的基因敲除对肿瘤动物模型的建立有重要意义，TP53基因敲除建立的肿瘤动物模型目前已有许多，其中非人灵长类动物中也有TP53基因敲除的动物模型，本发明主要针对肿瘤中常发生突变的外显子7、8上进行敲除，有可能为非人灵长类动物的各种肿瘤模型提供新的有效方法。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种靶向敲除TP53基因的sgRNA，其中TP53基因来自食蟹猴。

本发明的另一目的在于提供一种食蟹猴TP53基因敲除的方法，该方法为食蟹猴胚胎上的基因敲除方法，该基因敲除方法敲除食蟹猴TP53基因，进而有可能为制造非人灵长类肿瘤动物模型提供新的有效方法。

本发明通过设计、构建、筛选，最终提供靶向食蟹猴TP53基因的两个高效sgRNA及其靶位点序列，提供一种既可能获得单一位点突变，也可能实现两条sgRNA位点之间大片段的食蟹猴TP53基因敲除的方法，为建立非人灵长类肿瘤模型提供思路。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种靶向敲除TP53基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA为TP53-sgRNA 2-7和TP53-sgRNA 5-8，其核苷酸序列如下所示：

TP53-sgRNA 2-7：5’-CCGGTTCATGCCGCCCATGC(AGG)-3’；

TP53-sgRNA 5-8：5’-GGCAAGGCTCCCCTTTCTTG(CGG)-3’。

其中，括号内为PAM位点NGG，sgRNA识别位点。

本发明提供所述的靶向敲除TP53基因的sgRNA在TP53基因敲除领域中的应用。

本发明还提供一种食蟹猴TP53基因敲除的方法，包括如下步骤：体外合成所述的靶向敲除TP53基因的sgRNA，与Cas9 mRNA混合注射入食蟹猴胚胎，得到TP53基因敲除的食蟹猴胚胎。

作为本发明所述的食蟹猴TP53基因敲除的方法，其中的一种优选实施方式，所述体外合成靶向敲除TP53基因的sgRNA的具体操作步骤如下：