[发明专利]一种快速检测宠物病原体核酸检测的试剂、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种快速检测宠物病原体核酸检测的试剂、试剂盒及其应用，属于生物安全技术领域。具体来说，步骤T1，将待测样本在恒温环境中裂解；步骤T2，对裂解后的样本核酸进行TSA扩增；步骤T3，使用Cas蛋白检测扩增的核酸；步骤T4，使用胶体金试纸条对检测结果进行读数。T1采用带有核酸酶抑制剂的强碱性核酸提取液体提取样本中的核酸；T2包括UvsX蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bsu蛋白以实现等温核酸扩增；T3使用Cas蛋白技术对特定片段进行检测；T4利用Reporter和胶体金试纸条结合显示检测结果。本发明全程无需大型仪器设备和专业人员，且可以在短时间内高特异性地检测目的片段，适用于各种复杂检测场景，且能够准确检测目的核酸片段。

技术领域

本发明属于生物安全技术领域，具体地说，特别涉及一种可以快速常温对宠物感染病毒核酸检测的试剂、试剂盒及其应用。

背景技术

随着分子生物学技术得快速发展，它不仅仅涉及生物学、医学、遗传学、植物学、动物学等方面，更逐渐成为实际应用的底层技术。PCR作为一个已经较为成熟的技术，其具有高特异性、高效率等特点，但是一直难以摆脱需要洁净等级较高的实验室和专业的操作人员的束缚。

长期以来，生物活性样本中提取核酸(DNA和RNA)以及其纯化步骤繁多、耗时较多等缺点，使得核酸检测变成快速检测存在阻碍。尤其当检测样本中病原体滴度较低时，是否能将样本中的核酸完整提取并保存影响后续的检测结果。因此解决核酸提取步骤多、时间长这两个问题对于核酸检测具有重要意义。

对于粗糙样本(拭子、血液等)一般采用添加核酸酶抑制剂后水浴加热的方法，使得微生物或者细胞裂解，释放核酸。Hudson法即为加入EDTA和TCEP后，首先水浴60℃2分钟，将微生物灭活，随后升温到95℃10分钟，即得到混有核酸的提取液。由于其操作简单，无需提纯可以直接进行下一步检测，成本低廉，易操作，核酸损失量少等特点，可以作为快速检测的操作之一

市面上可以购买到的核酸提取液(保存液)通常加入了异硫氰酸胍作为裂解成分，虽然可以常温破坏病毒活性并且使核酸释放，但是通常需要十分钟以上的裂解时间以达到最好的提取效果。

此外还有一种常用的核酸提取方法就是碱裂解法。如中国专利申请CN201210242862.6，其利用强碱溶液在高温下让生物样本中的细胞发生裂解，释放出核酸，然后加入酸性缓冲液进行中和，进行离心，获得所提取的核酸溶液。其高温和离心步骤同时也给快速提取带来了困难。

不论采用Hudson法还是碱裂解法，利用现有技术提取和检测样本中的核酸都会涉及到加热步骤，而且加热过程的等待时间、使用电器和加热设备带来的危险性都与快速检测的初衷相反。

近年来，恒温扩增技术与CRISPR基因编辑技术结合为核酸恒温扩增检测技术的发展创建了一个新的平台。目前等温扩增和基因编辑检测病原体的步骤包括核酸提取、恒温扩增、Cas蛋白编辑以及产物检测。

核酸提取是核酸扩增技术中的关键步骤，但因实验室提取核酸的方法通常比较繁琐，需要一种简便、快速、高效、低耗能的核酸提取方法。常用的快速提取核酸的方法有固相提取试剂盒快速提取法，磁珠法，氧化铝膜法和裂解液处理法等。但固相提取法需要依靠仪器操作如离心机，磁珠法处理成本高，氧化铝膜法制造工艺复杂，限制了其在核酸快速检测中得到更实际有效的应用。裂解液恒温快速提取法操作简单、价格便宜、获取方便，是十分理想的核酸提取方法。

发明内容

1、要解决的问题