[发明专利]一种核酸提取纯化试剂盒及使用方法

说明书

本发明涉及一种核酸提取纯化试剂盒及使用方法，所述试剂盒包括如下组件：蛋白酶k溶液、磁珠悬浮液、离心纯化柱、收集管、裂解结合液、亚硫酸盐转化液、脱磺液、洗涤液、洗脱液。本发明所述试剂盒灵活的将游离DNA的提取和转化过程合二为一，先富集转化，再纯化浓缩。如此既节省了转化游离DNA的时间，又可以避免在提取过程中游离DNA的损耗。因此，本发明所述方法具有成本低、操作简短、转化率及回收率高等优点，为后续的甲基化特异性PCR扩增、亚硫酸盐测序等实验提供了高纯度的样品。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及到一种用于血浆游离DNA甲基化检测的核酸提取纯化试剂盒及使用方法。

背景技术

DNA甲基化是人类最早发现的表观遗传现象之一。所谓表观遗传，是指在不改变基因原始序列的情况下，调控基因的表达，使基因发生可遗传的变化，并最终导致个体（细胞）的表型发生改变。也就是说，基因组中含有两类遗传信息，一类是传统意义上的遗传信息，即基因编码的遗传信息；另一类是表观遗传信息，它提供了何时、何地、以何种方式去应用遗传信息的指令。从当前的研究来看，DNA甲基化、组蛋白印迹、非编码RNA等均属于表观遗传学的范畴。

DNA甲基化发生在DNA甲基转移酶的催化下，5’-CpG-3’位点中的胞嘧啶被选择性的添加上一个甲基，形成5-甲基胞嘧啶。人基因的启动子区及第一个外显子区富含5’-CpG-3’位点，一旦它们发生甲基化，该基因的转录过程就会收到抑制。研究表明，抑癌基因甲基化水平的异常升高是肿瘤发生的早期事件之一，因此近年来，DNA甲基化检测在癌症早期筛查领域的研究相当活跃。例如，对Septin 9基因进行甲基化检测在2016年就被FDA批准用于结直肠癌患者的早期筛查。

血液中游离DNA作为理想的检测对象，上面携带了来自人体内部各种细胞的基因组DNA的遗传信息，其中就包含了DNA甲基化。因此，利用游离DNA进行甲基化检测，能够实现无创的癌症早期筛查，应用前景十分广阔。然而，检测DNA甲基化的方法虽多，但大都绕不开亚硫酸盐转化过程。该过程在高温、高盐的条件下进行，使得非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，以和甲基化胞嘧啶区分。恶劣的反应环境使得超过70%的游离DNA损失在这一步，而回收回来的BiscfDNA也“伤痕累累”，碎片化十分严重，导致后续的PCR检测过程无法进行。

市面上现有的产品并不能直接获得BiscfDNA，必须经过“裂解→吸附→三次纯化→洗脱”获得游离DNA之后，再经过“转化→吸附→纯化→脱磺→两次纯化→洗脱”才能获得BiscfDNA。前后两个过程不仅操作繁琐、耗费时间和试剂，而且无法完全衔接，徒增游离DNA的损失。更重要的是，后一过程还要使用到高速离心设备，不能够实现自动化。这些缺点无疑给甲基化检测的普及带来了困难。尽管专利CN107868813A、CN108265050A和CN112143778A分别从不同的角度尝试解决这些问题，但又引入了高成本，应用范围窄等缺点。

发明内容

针对上述现有技术的缺陷与不足，本发明公开了一种核酸提取纯化试剂盒，简化了操作流程，增加了游离DNA的转化率与回收率，在两小时以内便能分离出高质量BiscfDNA，有助于基于血液游离DNA甲基化检测的癌症早筛普及。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种核酸提取纯化试剂盒，所述试剂盒包括如下组件：蛋白酶k溶液、磁珠悬浮液、离心纯化柱、收集管、裂解结合液、亚硫酸盐转化液、脱磺液、洗涤液。

所述蛋白酶k溶液的浓度为15-25mg/mL；优选为20mg/ml；

所述磁珠为表面修饰有羟基的二氧化硅包被的Fe₃O₄颗粒，其粒径为100-1000nm，磁珠悬浮液浓度为20-100mg/ml；优选为粒径1000nm，30mg/ml；所述离心纯化柱为底部带有硅胶模吸附柱的1mL规格的带盖EP管；

所述收集管为2 mL规格的无盖EP管；