[发明专利]血浆中提取游离DNA的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其是血浆中提取游离DNA的方法。该方法的具体步骤为，a、取血浆样本置于离心管内，然后在离心管内加入蛋白酶K和裂解液，并将离心管进行涡轮旋转或振荡混合均匀；b、将混合均匀的裂解混合物进行水浴，得到初级混合液；c、将初级混合液与结合液进行混合，再将离心管静置在磁力架上进行磁珠分离，并倒掉离心管内的废液，保留磁珠；d、再在离心管内倒入浓度为75％‑85％的乙醇，并将离心管内的乙醇和磁珠混合；e、用漂洗液对磁珠进行清洗。本发明通过蛋白酶K和裂解液来裂解血浆样本，通过结合液的混合，配合乙醇与漂洗液对磁珠进行清洗，通过洗脱液让磁珠进行磁分离，从而提高了游离DNA的提取纯度。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是血浆中提取游离DNA的方法。

背景技术

游离DNA也叫cell free DNA，一般存在于血浆、血清、胸腹水、脑脊液等样本中，含量较少。血浆是血液除去血细胞和血小板外的液体组分，约占全血体积的50-60％。通过抗凝采血管采集血液，离心后收集到的上层淡黄色液体即为血浆。Mandel等人在1948年首次报道了血浆中游离DNA(cell free DNA，cfDNA)的存在，它是一种胞外DNA，主要是由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成。健康人和肿瘤患者外周血中均存在cfDNA，而肿瘤患者外周血中cfDNA的含量约为健康人的10倍以上。床研究表明，cfDNA能有效反映患者整体的肿瘤负荷、恶性程度、转移能力以及实时的基因突变信息。现有的游离DNA提取方法有化学法和吸附法，但是现有的提取方法的提取纯度不高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：为了解决背景技术中描述的技术问题，本发明提供了一种血浆中提取游离DNA的方法。通过蛋白酶K和裂解液来裂解血浆样本，通过结合液的混合，配合乙醇与漂洗液对磁珠进行清洗，通过洗脱液让磁珠进行磁分离，从而提高了游离DNA的提取纯度。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种血浆中提取游离DNA的方法，该方法的具体步骤为：

a、取血浆样本置于离心管内，然后在离心管内加入蛋白酶K和裂解液，并将离心管进行涡轮旋转或振荡混合均匀；

b、将混合均匀的裂解混合物进行水浴，得到初级混合液；

c、将初级混合液与结合液进行混合，再将离心管静置在磁力架上进行磁珠分离，并倒掉离心管内的废液，保留磁珠；

d、再在离心管内倒入浓度为75％-85％的乙醇，并将离心管内的乙醇和磁珠混合；

e、用漂洗液对磁珠进行清洗；

f、将洗脱液放入离心管内，然后将离心管置于磁力架上进行磁分离，最后将离心管内的上清液吸出，上清液即为游离DNA。

具体地，所述裂解液由如下重量份数的组分组成：盐酸胍3-5份、异硫氰酸胍0.8-2.5份、碘化钠1-3份、异丙醇10-20份、水2-5份。

具体地，所述结合液由如下重量份数的组分组成：盐酸胍7-13份、柠檬酸1-3份、异丙醇20-50份、乙酸1-4份、EDTA 5-8份。

具体地，所述漂洗液由如下重量份数的组分组成：异硫氰酸胍5-10份、碘化钠2-6份。

具体地，所述洗脱液由如下重量份数的组分组成：Tris-HCl 5-8份、EDTA1-3份、三羟甲基氨基甲烷6-12份。

具体地，步骤a中，所述血浆样本与裂解液的比例为1：4，所述涡轮旋转的转速为8000-9500rpm。

具体地，步骤b中，所述水浴温度为55-60摄氏度，水浴时间为1-1.2小时。