[发明专利]一种痕量柑橘黄龙病菌快速检测方法

说明书

本发明公开了一种痕量柑橘黄龙病菌快速检测方法，包括以下步骤：步骤一、垂直切取柑橘叶片的叶中脉和/或叶柄得到薄片样品，加入裂解液中研磨处理后离心；步骤二、取上清液进行PCR扩增反应，并对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。该方法操作简单，成本低，只需微量植物组织样品，且能够快速获得检测结果；另外，该方法不仅能够对植物是否感染黄龙病菌进行定性分析，还能区分不同部位的发病程度，为柑橘黄龙病菌的快速鉴定提供了新的检测技术。

技术领域

本发明属于病原微生物检测技术领域，具体涉及一种痕量柑橘黄龙病菌快速检测方法。

背景技术

柑橘黄龙病(Huanglongbing)是世界范围内柑橘生产上的毁灭性病害，其病原为韧皮部限制性寄生菌，主要分为亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)、非洲种(Ca.Liberibacter africanus,CLaf)和美洲种(Ca.Liberibacter americanus,Clam)(Jagoueixet al,1994；Bové,2006)。柑橘黄龙病菌极具破坏性，严重威胁柑橘产业的健康发展，被列为我国对内对外的检疫性有害生物。迄今为止，柑橘黄龙病菌尚无法获得离体纯培养。其传播主要通过虫媒介体柑橘木虱、柚喀木虱进行近距离传播，通过苗木、接穗等进行远距离传播。

目前，针对柑橘黄龙病菌的诊断方法主要包括田间症状诊断法、血清学诊断法、电镜诊断法、PCR及其衍生技术等(如巢式PCR、荧光定量PCR等)。特别是基于PCR的分子检测技术使检测的灵敏度和准确性不断提升，但是在操作过程中样品DNA的提取较为耗时、需要特殊的仪器设备(离心机、水浴锅等)、步骤相对繁琐，严重限制了分子检测技术在基层单位的应用和推广。

另外，柑橘感染黄龙病菌后，染病植株叶片表现为斑驳黄化、均匀黄化、缺素型黄化、脉凸加黄化等黄化症状，果实则表现为红鼻果。但当病菌含量极少时，特别是染病早期，植株外观上并未有明显变化，而且柑橘黄龙病菌在植株体内分布不均匀，故采用PCR技术鉴定黄龙病菌时常常会因为材料选取的问题导致检测结果不准确，如选取过多的材料会在一定程度上稀释黄龙病菌的滴度，过少的材料特别是没有取到关键部位的材料用于检测则会造成假阴性结果。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种痕量柑橘黄龙病菌快速检测方法，该方法操作简单，且只需要微量植物组织样品，即可准确、快速获得检测结果。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

一种痕量柑橘黄龙病菌快速检测方法，包括以下步骤：

步骤一、垂直切取柑橘叶片的叶中脉和/或叶柄得到薄片样品，加入裂解液中研磨处理后瞬时离心；

步骤二、取上清液进行PCR扩增反应，并对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

进一步地，在上述技术方案中，用于柑橘黄龙病菌检测的材料的选取至关重要，本发明经过大量实验的重复验证，发现在采用叶片作为检测样品时，叶柄的中间部分(图1中2^nd～3^rd之间)和叶中脉的前端(即靠近叶柄端，具体如图1中4^th～5^th之间)是最佳的取样部位。

进一步地，在上述技术方案中，薄片样品的厚度为0.1～0.15mm，用于PCR检测时，可直接单片提取DNA检测，也可选取2～6个薄片样品混合制样检测。

进一步地，在上述技术方案中，裂解液为NaOH溶液；在技术效果较佳的实施例中，可选择用0.5mol/L的NaOH溶液，此时提取过程可以为：选取1～6个薄片样品，放入0.5mol/L的NaOH溶液，用无菌研磨棒研磨后瞬时离心取上清液。

更进一步地，根据实际需求，所得上清液可直接用于PCR扩增反应，也可以采用TEbuffer(PH＝8)稀释后再用于PCR扩增反应。