[发明专利]一种快速分离鉴定益生菌种属和益生功能的筛选方法

权利要求书

1.一种快速分离鉴定益生菌种属和益生功能的筛选方法，其特征在于：筛选步骤分为益生菌分离鉴定和体外抑菌效果试验，所述益生菌分离鉴定步骤如下：

S1：培养基准备，采用LB固体和液体培养基、乳酸细菌培养基MRS固体和液体培养基；

S2：菌液制备，无菌采集盲肠内容物和黏膜，置于无菌生理盐水中，混匀；

S3：菌种分离，分别对乳酸菌类分离和芽孢杆菌分离；

S4：培养；

S5：初筛纯化，进行乳酸菌纯化和枯草芽孢杆菌纯化；

S6：鉴定。

2.根据权利要求1所述的一种快速分离鉴定益生菌种属和益生功能的筛选方法，其特征在于：基于益生菌分离鉴定步骤的S2中：

菌液制备流程为：选择健康活鸡5只，实验前1周禁止使用任何抗生素药物，每只无菌采集盲肠内容物和粘膜1g放置于盛有45mL无菌生理盐水的离心管中，涡旋混匀，制成菌液。

3.根据权利要求1所述的一种快速分离鉴定益生菌种属和益生功能的筛选方法，其特征在于：基于益生菌分离鉴定步骤的S3中：

乳酸菌类分离流程为：采用无菌枪头从中吸取100ul悬液加入盛有900ul无菌生理盐水的1.5ml离心管中充分混匀，然后用无菌枪头从此离心管中吸取100ul加入另一盛有900ul无菌生理盐水的1.5ml离心管中，吹吸混合均匀；

以此类推，制成10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释度的溶液，用无菌枪头分别由10-3、10-4、10-5三种稀释度中各吸取200ul，分别滴在MRS固体培养基表面中央位置；

用无菌涂布器涂布均匀，室温下静置5-10min，使菌液浸入培养基。

4.根据权利要求1所述的一种快速分离鉴定益生菌种属和益生功能的筛选方法，其特征在于：基于益生菌分离鉴定步骤的S3中：

芽孢杆菌分离流程为：采用80℃水浴处理1h，用无菌枪头从中吸取100ul悬液加入盛有900ul无菌生理盐水的1.5ml离心管中充分混匀，然后用无菌枪头从此离心管中吸取100ul加入另一盛有900ul无菌生理盐水的1.5ml离心管中，吹吸混合均匀；

以此类推，制成10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释度的溶液，用无菌枪头分别由10-3、10-4、10-5三种稀释度中各吸取200ul，分别滴在LB固体培养基表面中央位置；

用无菌涂布器涂布均匀，室温下静置5-10min，使菌液浸入培养基。

5.根据权利要求1所述的一种快速分离鉴定益生菌种属和益生功能的筛选方法，其特征在于：基于益生菌分离鉴定步骤的S4中：

将S3中菌液置于培养基平板倒置于37℃恒温培养箱中，培养24小时。

6.根据权利要求1所述的一种快速分离鉴定益生菌种属和益生功能的筛选方法，其特征在于：基于益生菌分离鉴定步骤的S5中：

乳酸菌纯化流程为：挑取MRS培养基上形态不同的菌落编号，分别在MRS培养基上划线纯化，37℃纯培养24h，后置于4℃冰箱备用。

7.根据权利要求1所述的一种快速分离鉴定益生菌种属和益生功能的筛选方法，其特征在于：基于益生菌分离鉴定步骤的S5中：

枯草芽孢杆菌纯化流程为：挑取NA培养基上灰白色边缘波纹状表面粗糙的疑似菌落编号，在NA培养基上划线纯化，37℃纯培养24h，后置于4℃冰箱备用。

8.根据权利要求1所述的一种快速分离鉴定益生菌种属和益生功能的筛选方法，其特征在于：基于益生菌分离鉴定步骤的S6中：

鉴定采用测序的方法对纯化菌PCR扩增16sRNA序列进行测序，通过NCBI网站Blast分析，确定菌株种类；

引物序列如下：

27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG

1492R：TACGGYTACTTGTTACGACT；

PCR扩增条件95℃5分钟；95℃5秒、56℃30秒、72℃120秒35循环；72℃10分钟。