[发明专利]一种产琥珀酸放线杆菌CRISPRi系统构建方法

说明书

本发明公开了一种产琥珀酸放线杆菌CRISPRi系统构建方法，属于生物技术领域。本发明提供的CRISPRi系统以表达载体pLGZ92M为骨架载体，其主要作用元件包括cpf1表达元件和crRNA表达元件，其中pckA启动子启动表达dcpf1蛋白，frd启动子启动表达crRNA，由终止子rrnB t1终止子终止。本发明提供的CRISPRi系统只需更换针对靶基因的crRNA即可实现对靶基因产生抑制作用。本发明的方法针对产琥珀酸放线杆菌实现基因抑制，操作过程简单，转化效率高。

技术领域

本发明涉及一种产琥珀酸放线杆菌CRISPRi系统构建方法，属于生物技术领域。

背景技术

产琥珀酸放线杆菌是一株从牛的瘤胃中分离的高产琥珀酸的革兰氏阴性菌，它能天然的生产琥珀酸，且能利用广谱的碳源用于生产琥珀酸，是生产琥珀酸最有潜力的微生物之一。但由于缺乏对产琥珀酸放线杆菌遗传背景的认知，以及缺少相应的遗传操作工具，产琥珀酸放线杆菌的基因工程改造落后于E.coli。目前报道的产琥珀酸放线杆菌的遗传工具很少，Kim等在胸膜肺炎放线杆菌与大肠杆菌穿梭质粒pGZRS-19基础上成功构建了载体pLGZ920，实现外源基因在琥珀酸放线杆菌中的表达(US 20050164360A1)。借助产琥珀酸放线杆菌含大量的USS序列、膜结合DNA吸收机制的自然转化能力、以及异柠檬酸脱氢酶缺陷型的特点，该研究小组进一步建立了产琥珀酸放线杆菌的无痕敲除方法(Applied andEnvironmental Microbiology.Joshi,2014,80(10):3053.)。之后，美国国家可再生能源实验室利用Cre/Frt系统在产琥珀酸放线杆菌构建了另一比较简便的基因敲除方法(Appliedand Environmental Microbiology,2017)。姜岷等人利用自杀质粒，通过接合作用转入产琥珀酸放线杆菌中，再通过同源重组双交换和抗性筛选构建了一套基因敲除系统(CN107916247A)。但以上的遗传操作工具，依然过程繁琐，实验周期长，因此，须建立一套高效简便的遗传工具利于对产琥珀酸放线杆菌的遗传背景研究及获得提高琥珀酸的产量的优良菌株。

CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas)基因编辑系统是自ZFNs、TALENs发展而来的第三代基因编辑系。CRISPR/Cas是一种广泛存在于细菌或古生菌的一种适应性免疫系统。该系统可以在RNA引导的核酸酶的作用下切割外来核酸，抵御噬菌体等的入侵。利用CRISPR/Cas系统这一特性，可构建简便高效的基因编辑工具。其中CRISPR/Cas系统中的II型系统较为简单，目前大部分的CRISPR工具都是由类型II中CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1(Cas12a)改造而来。除基因编辑外，直接将cas9或Cpf1蛋白的关键位点失活，得到不具有核酸酶切割活性但仍具备特异性DNA识别和结合能力，可以实现对特定基因表达的抑制，这种机制被称为CRISPRi。CRISPRi已经被用在越来越多的模型菌株和非模型菌株中，在重塑代谢途径，识别新的高效代谢酶及优化底盘细胞等方面发挥巨大的作用。但是，就天然产琥珀酸的产琥珀酸放线杆菌，还缺少此类CRISPR/Cas遗传操作工具。

发明内容

本发明的目的是建立一种产琥珀酸放线杆菌CRISPRi系统方法，为产琥珀酸放线杆菌提供高效的遗产操作工具，利用该遗传操作工具可对产琥珀酸放线杆菌的基因表达进行有效抑制。

为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种CRISPRi系统，所述CRISPRi系统包含质粒pCpf1-CRISPRi，所述质粒pCpf1-CRISPRi包含编码dCpf1的基因和crRNA表达框；所述编码dCpf1的基因位于pckA启动子下游，所述crRNA表达框位于dCpf1基因的下游。

在本发明的一种实施方式中，所述crRNA表达框包含frd启动子、crRNA序列和rrnBt1终止子。