[发明专利]一种快速构建衰老细胞的方法和试剂盒

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体的涉及一种快速构建衰老细胞的方法和试剂盒。本发明利用衰老细胞可分泌衰老细胞相关分泌表型，制备条件培养基，使SASP影响细胞生存环境，诱导细胞衰老的发生，该衰老细胞具有复制性衰老的特征，表现为端粒长度显著缩短，本发明6～8周即可诱导复制性细胞衰老的发生，可显著缩短构建衰老细胞株的时间。本发明还可模拟机体内细胞衰老现象。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的涉及一种快速构建衰老细胞的方法和试剂盒。

背景技术

衰老是一种在生物体普遍发生的现象，即不可逆的增值一直状态。衰老会导致多种退化病理，其特征是多种慢性疾病、虚弱和丧失独立性。世界人口老龄化正在迅速增长，这进一步威胁到社会和经济的稳定。生物医学研究的巨大挑战之一是缩短(如果不能消除的话)衰老的周期，并增加健康寿命。直到最近，人们才注意到衰老和慢性疾病之间的深刻联系，但对此进行干预的希望渺茫。毫无疑问，在阐明衰老相关机制的基础上，打破基本衰老过程与慢性疾病之间的联系，使衰老成为一个可改变的因素，在临床实践中至关重要。越来越多的证据表明，与衰老相关的功能障碍可能是由一个或多个基本过程驱动的，这激发了人们对这些过程的研究，并找到新的策略或药物干预措施。

与衰老相关疾病密切相关的主要基本过程之一是细胞衰老。细胞衰老是指不可逆的生长停滞，发生在培养或在体内的反应，细胞内和细胞外的压力。大约50年前，Hayflick和他的同事首次描述了人类成纤维细胞(WI-38成纤维细胞)在细胞分裂50次后达到永久性的停滞，失去了在培养中增殖的能力。尽管当时遇到了一些怀疑，细胞衰老的研究已经开始。迄今为止，根据其发生的原因，已确定了三种类型的细胞衰老。复制性衰老(RS)是Hayflick在1961年发现的第一个与增殖限制有关的细胞衰老，其原因是端粒缩短(所谓的“已发现的DNA末端复制问题”)。此外，细胞在各种刺激下也可能发生衰老，被称为应激诱导的早衰(SIPS)。目前，已经检测到不同的应激源，包括但不限于DNA损伤(独立于端粒缩短)、致癌、氧化和基因毒性来源。RS和SIPS似乎依赖于相同的途径来诱导细胞周期阻滞，如p53-p21CIP1和p16lnk4a-视网膜母细胞瘤蛋白(pRB)抑制E2F。然而，两者之间有很大的区别，SIPS中细胞周期阻滞所需的时间更短，而RS中端粒更短。有趣的是，发育程序性衰老(developmental programming senescence，DPS)作为最新的细胞衰老途径，最早在胚胎发生的第一天被发现，其特征是p21依赖的细胞周期阻滞。DPS未检测到DNA损伤，也未检测到与DNA损伤相关的ATM或ATR的激活。

综上所述，构建衰老细胞是研究如何抗衰老药物的第一步，而模拟复制性衰老细胞构建是其中的关键。现有技术中虽然也能够构衰老细胞，但是需要的时间久，大约20至25周，极大的影响了工作的效率，延长了项目的周期。

发明内容

本发明为了解决上述背景技术中现有的构建衰老细胞耗时久的技术问题，提供一种快速构建衰老细胞的方法和试剂盒。

本发明采用的技术方案如下：

本发明一方面提供了一种快速构建衰老细胞的方法和试剂盒，包括以下步骤：

S1、复制性衰老细胞的构建：取PDL小于30的年轻细胞于细胞培养皿中，加入含10％的FBS和1％的青霉素-链霉素的RMPI1640培养基培养，当所述年轻细胞的细胞融合度为70％～80％时，利用0.25％的胰蛋白酶消化传代，细胞培养140天，得到复制性衰老细胞；

S2、条件培养基的制备：将步骤S1中得到的所述复制性衰老细胞于细胞培养皿中过夜贴壁后更换并置于含10％的FBS和1％的青霉素-链霉素的RMPI1640培养基中，继续培养48～52h后收集细胞上清液，接着离心后过滤，取滤液按照1∶2的比例与含10％FBS和1％青霉素-链霉素的RMPI1640培养基混合，得到条件培养基；