[发明专利]一种基于内滤效应的用于样品中碱性磷酸酶活力测定的比率荧光分析法

说明书

本发明提供了一种基于内滤效应的用于样品中碱性磷酸酶活力测定的比率荧光分析法，属于酶活力检测技术领域。包括：将样品与孵育缓冲液混合、孵育、静置，得到静置液；将静置液与量子点溶液混合，得到混合液，以310nm激发，测定所述混合液在405nm和585nm下的荧光强度，得到585nm与405nm的荧光强度比值，定义为R，将空白样品的荧光强度比值定义为R0，得到R/R0；将R/R0代入公式，得到样品中碱性磷酸酶活力。本发明提出的基于内滤效应的比率荧光分析法具有无标记检测、无需样品前处理、较低的生物基质干扰的明显优势，为复杂生物基质中碱性磷酸酶活力检测提供了一种简便、灵敏、选择性、样品消耗少的新方法。

技术领域

本发明属于酶活力检测技术领域，尤其涉及一种基于内滤效应的用于样品中碱性磷酸酶活力测定的比率荧光分析法。

背景技术

碱性磷酸酶是一种重要的磷酸单酯酶，存在于包括血清在内的绝大多数人体组织中。碱性磷酸酶活力的异常变化与肝胆疾病、骨骼疾病、肾病以及癌症有关，因此便捷、灵敏、高选择性的ALP活力检测对于疾病诊断至关重要。比色法，电化学法以及荧光分析法已经被用于ALP活力检测。这些方法各有优势，但是都存在一些不可避免的问题，例如比色法灵敏度较低，电化学方法要求复杂的原理设计与化学修饰。荧光法简便、灵敏，在酶活力分析、免疫分析中得到广泛应用，然而常规的荧光法往往由于有机小分子染料较差的光稳定性、水不溶性而受到限制，此外生物基质对荧光团得影响也不容忽视。

近年来，量子点(QDs)以其优异的光稳定性、良好的水溶性以及明亮的荧光而受到关注，并且作为一种新型荧光材料被广泛应用于药物、生物标志物、病毒的检测。在多数与量子点相关的荧光检测方法中，荧光信号的增强或者猝灭依赖于量子点与目标物或其他中间分子的相互作用，实现这种特异性相互作用的有效途径是将QDs与分子印迹、适配体、抗体等识别工具偶联，然而这种偶联容易导致QDs的聚集或发光强度的降低。实际上，构建高质量的识别工具功能化量子点仍是一个巨大的挑战。此外，荧光信号容易受到环境因素以及加样误差的影响，导致传统的荧光分析法检测结果波动较大、稳定性与重现性差。内滤效应(IFE)是指体系中吸光物质的吸收光谱与荧光团的激发光谱或发射光谱重叠时，通过竞争性吸收激发光或发射光而导致荧光团猝灭的现象。内滤效应只需满足光谱重叠即可实现，并不要求吸光物质与荧光团之间有某种相互作用，因此这是一种实现无标记检测的重要途径。此外，由于量子点具有宽泛的激发光谱，以量子点作为荧光团时吸光物质的选择以及检测方法的设计更为灵活。近年来，基于量子点与内滤效应构建的荧光分析法已经应用于农药、治疗药物、生物标志物的检测。

在以往的报道中，荧光分析法已经用于碱性磷酸酶的活力检测。然而，生物基质对单波长荧光信号的严重干扰限制了这些方法在血清等复杂生物基质中的应用。在一些研究中，通常会采取稀释样品或者提取目标物等措施来降低基质对荧光信号的干扰，然而对样品的稀释也会导致目标物的稀释，这要求方法的灵敏度必须足够高；另外，繁琐的样品前处理过程既增加了操作人员的工作量，也可能导致检测结果的准确性下降。与单波长荧光分析法不同，比率荧光分析法以多个波长荧光强度比值作为检测信号。在某些情况下，多波长处的荧光强度在干扰物质存在时具有相同的变化趋势，虽然单波长处的荧光强度受到严重干扰，但多波长的荧光强度比值却几乎不受影响。比率荧光分析法已经成为一种降低生物基质干扰的重要途径，并且已经被用于生物基质中大分子与小分子的检测。因此，基于量子点与内滤效应的比率荧光分析法是实现生物基质中高选择性、高灵敏度、简便的碱性磷酸酶活力检测的一种有前景的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于内滤效应的用于样品中碱性磷酸酶活力测定的比率荧光分析法，本发明提出的基于内滤效应的比率荧光分析法具有无标记检测、无需样品前处理、较低的生物基质干扰的明显优势，为复杂生物基质中碱性磷酸酶活力检测提供了一种简便、灵敏、选择性、样品消耗少的新方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种基于内滤效应的用于样品中碱性磷酸酶活力测定的比率荧光分析法，包括以下步骤：