[发明专利]一种检测BRCA1基因突变的试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种检测BRCA1基因突变的试剂盒及方法。所述试剂盒包括正义引物、反义引物和耐高温限制性内切酶，所述正义引物和反义引物为分别结合BRCA1基因c.981_982区的上游和下游的引物，所述耐高温限制性内切酶切割BRCA1基因c.981_982区野生型片段。本发明巧妙结合PCR扩增和限制酶切，开发富集BRCA1基因突变区片段的方法，可实现快速富集，且产物可直接进行后续检测，能够提高低丰度突变的检测灵敏性，操作简便，成本低，无需增加额外设备，利用广泛推广应用。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种检测BRCA1基因突变的试剂盒及方法。

背景技术

乳腺癌易感基因BRCA1，位于17号染色体长臂21区，约81kb，内含22个外显子，编码一个由1863个氨基酸组成的乳腺癌易感蛋白BRCA1。乳腺癌易感蛋白BRCA1主要参与细胞周期调控、DNA损伤修复、基因转录激活、肿瘤生长抑制等细胞活动，该蛋白上的BRCA羧基端(BRCA carboxyl terminus，BRCT)结构域结合其磷酸配体的能力对BRCA1肿瘤抑制能力至关重要。

BRCA1/2突变引起的乳腺癌占乳腺癌总数的5％～10％，而且携带BRCA1突变的女性有患乳腺癌的风险，除乳腺癌外，BRCA基因的突变主要还会引起卵巢癌的发生，另外，也有少部分突变携带者会罹患前列腺癌、皮肤癌和胰腺癌等。BRCA的基因片段较大，突变点很多，但都比较分散。在乳腺癌信息中心(BIC)，其中，BRCA1基因已经有约1800多个突变被发现与乳腺癌相关。目前，由于区域分布广、人口和经济差异大，对乳腺癌的普通临床筛查未完全普及，针对乳腺癌的基因检测也相对缺乏，因此，进行普及基因检测对于乳腺癌的预防和治疗都有很重要的意义。

循环肿瘤DNA(ctDNA)突变检测是近年来兴起且发展迅速的肿瘤诊断技术，称为“液体活检”。ctDNA是由肿瘤细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统产生；随着基因测序的飞速发展，目前，已能在血液中对其进行检测并计数。ctDNA是一种特征性的肿瘤生物标记物，并且还可以被定性、定量和追踪，与组织活检相比ctDNA检查微创小、无放射性污染、经济、新DNA无防腐剂污染等优点，并允许对治疗反应实时监测。

由于ctDNA含量低(1.0％总cfDNA)，片段短(180～200bp)，半衰期短(～2小时)，故其检测对痕量核酸检测技术提出全新的挑战。目前具备极微量核酸基因突变检测能力的技术主要有ARMS技术(包括Super-ARMS)、第二代测序(NGS)和数字PCR(ddPCR，包括BEAMing技术)等。NGS技术可检测未知突变且检测基因数量不受限，在肿瘤耐药突变的监测与研究等领域有很大的应用潜力。然而，NGS建库技术复杂，常规建库测序方法使得血浆中含量极低的肿瘤信号完全淹没在背景噪声中，建库过程原始信息丢失严重或成为敏感度潜力发挥的限制因素。数字PCR技术，具有极高的敏感性，可绝对定量，但该方法检测通量较低。由于，ctDNA含量极少，且肿瘤DNA分子存在的数量远远不及正常细胞的DNA，肿瘤相关DNA被来自正常细胞DNA严重稀释，单分子丰度仅0.01％，化验结果极易被干扰，因此，能够特异性的富集样品中靶序列的富集技术是液体活检技术发展的关键。

综上所述，提供一种能够高效富集并检测血浆游离DNA中BRCA1基因突变区的方法，对于BRCA1基因检测领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种检测BRCA1基因突变的试剂盒及方法，通过靶向富集样本中BRCA1基因c.981_982delAT突变基因片段，提高该突变的检测灵敏度。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种检测BRCA1基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括正义引物、反义引物和耐高温限制性内切酶，所述正义引物和反义引物为分别结合BRCA1基因c.981_982区的上游和下游的引物，所述耐高温限制性内切酶切割BRCA1基因c.981_982区野生型片段。