[发明专利]利用tRNA多个串联sgRNA表达里氏木霉CRISPR/Cas9的建立方法及应用

权利要求书

1.一种sgRNA表达盒，其特征在于，所述sgRNA表达盒从5’-3’具有以下结构：P-R-A-S-R-B-S-R-C-S-R-D-S-R-T，其中P为启动子、R为编码里氏木霉甘氨酸的tRNA序列、A、B、C、D为分别靶向不同基因的sgRNA中的20bp的原间隔序列、S为sgRNA序列骨架；T为T₆终止子。

2.如权利要求1所述的sgRNA表达盒，其特征在于，当靶向更多位点时，在所述T之前重复添加-N-S-R-序列即可，N为任意靶位点的原间隔序列；

编码里氏木霉甘氨酸的tRNA序列具体如SEQ ID NO.1所示；

所述启动子为5S rRNA，其序列具体如SEQ ID NO.2所示；

所述sgRNA序列骨架为来自化脓性链球菌的sgRNA序列，进一步，所述sgRNA序列骨架其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种tRNA-spacer系统，其特征在于，所述tRNA-spacer系统包括连有两个或两个以上的相应的sgRNA的表达盒的Cas9基因的表达载体。

4.如权利要求3所述tRNA-spacer系统，其特征在于，所述表达载体含AMA1自主复制元件和抗性标记；

所述tRNA-spacer系统还包括一个或多个分别针对待编辑的基因的同源供体DNA序列。

5.权利要求1-2任一项所述sgRNA表达盒和/或权利要求3和4任一项所述tRNA-spacer系统在基于CRISPR/Cas9基因编辑技术针对木霉进行基因编辑中的应用；

所述基因编辑包括基因敲除以及供体DNA同源整合。

6.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述木霉为里氏木霉；

具体的，所述应用包括：对里氏木霉的基因组进行多基因编辑，敲除纤维二糖水解酶1CBH1(P62694.1)、纤维二糖水解酶2基因CBH2(P07987.1)，并在cbh1的基因座位置引入过表达A.niger FGX55的葡萄糖氧化酶gox基因(EU532181.1)。

7.一种利用tRNA多个串联sgRNA表达里氏木霉CRISPR/Cas9的建立方法，其特征在于，所述建立方法包括：

S1、构建含ptrA抗性筛选标记和Cas9表达盒的质粒；

S2、设计并合成包含两个靶向cbh1和cbh2的sgRNA表达盒；

S3、构建靶向cbh1和cbh2定位敲除的CRISPR/Cas9载体；

S4、构建表达葡萄糖氧化酶的供体DNA融合片段；

S5、利用通过CRISPR/Cas9利用tRNA-spacer系统对里氏木霉同时进行多串联sgRNA表达的多基因编辑系统构建葡萄糖氧化酶表达菌株。