[发明专利]利用tRNA多个串联sgRNA表达里氏木霉CRISPR/Cas9的建立方法及应用

说明书

本发明提供一种利用tRNA多个串联sgRNA表达里氏木霉CRISPR/Cas9的建立方法及应用，属于基因工程和生物技术领域。本发明提供一种通过CRISPR/Cas9利用tRNA‑spacer系统对里氏木霉同时进行多串联sgRNA表达的多基因编辑系统，其中所述tRNA‑spacer系统是以里氏木霉编码甘氨酸的tRNA为间隔sgRNA的方式利用内源tRNA的加工方式从单个转录本释放多个靶向不同位点的sgRNA，继而通过构建同时含有Cas9、sgRNA和筛选标记的自主复制型CRISPR/Cas9载体，在里氏木霉中建立起精准定位靶向多基因编辑系统的CRISPR/Cas9技术，具有良好的实际应用之价值。

技术领域

本发明属于基因工程和生物技术领域，具体涉及里氏木霉基因组的改造，进一步涉及利用tRNA多个串联sgRNA表达里氏木霉CRISPR/Cas9的建立方法及应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

里氏木霉具有分泌蛋白质的良好能力，可进行高效的蛋白质折叠与质量控制、系统的真核蛋白修饰以及有效的囊泡运输和分泌，从而有望成为工业化生产重组蛋白质的高效微生物细胞工厂。目前，里氏木霉已被应用于表达多种外源蛋白，如表达来自土曲霉的β-葡萄糖苷酶、人的干扰素α-2b以及南极念珠菌的脂肪酶B。里氏木霉在诱导条件下可产生大量的纤维素酶和半纤维素酶，然而这会消耗能量并产生大量的背景蛋白，不利于异源蛋白质的表达和纯化。使用组成型启动子驱动表达异源蛋白，可在葡萄糖条件下发酵，大大减少內源酶/蛋白的产生，但其表达产量远低于诱导型表达。因此，为提高靶标蛋白产量且降低背景蛋白影响，使用纤维素酶基因的诱导型启动子驱动靶标蛋白表达的同时敲除主要纤维素酶基因，已成为里氏木霉有效的异源蛋白表达策略，然而多基因敲除技术在里氏木霉中不是很成熟方便，需要进一步探索。

CRISPR/Cas系统用于基因编辑简便高效且能多基因编辑，其中来自化脓性链球菌II型的CRISPR/Cas9由于其简单方便而成为研究的热点。Cas9蛋白是一个RNA介导的核酸内切酶，可切割双链DNA，由两个活性部分组成：HNH结构域和RuvC结构域。HNH区可以切断与crRNA互补的DNA链，RuvC结构域负责切断与crRNA不互补的DNA链。Cas9需要融合核定位序列(NLS)才能靶向真核核基因组，同时包含crRNA和tracrRNA的单导RNA(sgRNA)引导Cas9到达目标位点。sgRNA负责识别原间隔相邻基序(PAM)NGG位点上游的20个核苷酸序列原间隔序列(protospacer)。Cas9蛋白负责剪切PAM上游的3-4个碱基，导致双链断裂(DSB)。DSB通常由非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)进行修复。NHEJ修复是通过插入或缺失(indel)产生基因中断。HR修复则可将供体DNA通过替换或插入整合到基因组。

目前CRISPR/Cas9在里氏木霉中成功应用，也尝试了多基因编辑的方法，如分别构建多个sgRNA转录本或者体外组装多个Cas9-gRNA复合物形成核糖核蛋白(RNPs)，然后转化原生质体中进行基因组编辑，这两种方法费时费力每次都需重复构建整个sgRNA表达盒，前者需探索各个sgRNA表达盒的浓度比例以提高效率，而后者体外sgRNA稳定性影响效率且操作难度大。所以，研发一种简便的多sgRNA表达策略十分必要。经检索，在里氏木霉中构建tRNA-spacer系统应用于多串联sgRNA表达，将其连入携带复制因子AMA1的游离于染色体外的自主复制质粒构建Cas9表达载体(含抗性筛选标记)，从而构建了一种通过CRISPR/Cas9利用tRNA-spacer系统对里氏木霉同时进行多串联sgRNA表达的多基因编辑系统，该系统目前尚无报道。

发明内容