[发明专利]一种双向启动子及其过表达载体、慢病毒表达质粒和应用

权利要求书

1.一种双向启动子，其特征在于，所述双向启动子的结构如a)或b)：

a)所述双向启动子包括第一启动单元和第二启动单元，分别与所述第一启动单元和第二启动单元连接的外源基因的延伸方向从5′至3′相反；

所述第一启动单元由以下启动子元件组成：启动子CMV及其增强子CMV enhancer和启动子EF1；所述增强子CMV enhancer位于启动子CMV转录方向的上游；

所述第二启动单元为启动子EF1；

所述第一启动单元和第二启动单元之间插入有相互连接的pause site终止转录元件和Poly(A)元件，所述pause site终止转录元件的另一侧连接至所述增强子CMV enhancer，所述Poly(A)元件的另一侧连接至所述启动子EF1；

b)所述双向启动子由以下启动子元件组成：启动子EF1、增强子CMV enhancer和启动子CBH，在所述增强子CMV enhancer的序列中插入有Poly(A)序列，分别与所述启动子EF1和启动子CBH连接的外源基因的延伸方向从5′至3′相反。

2.根据权利要求1所述的一种双向启动子，其特征在于，如a)结构的双向启动子的核苷酸序列如下(a1)或(a2)所示：

(a1)具有如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

(a2)将(a1)中所述DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；

如b)结构的双向启动子的核苷酸序列如下(b1)或(b2)所示：

(b1)具有如SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

(b2)将(b1)中所述DNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子。

3.一种过表达载体，其特征在于，所述过表达载体包含权利要求1所述的双向启动子。

4.根据权利要求3所述的过表达载体，其特征在于，所述过表达载体通过以下方法构建得到：

将如SEQ ID NO.4的片段合成在puc57载体上作为模板扩增，将扩增产物与出发载体产物进行无缝克隆连接既得；

其中，扩增引物为AGCAGAGATCCAGTTTATCGATCCATAGAGCCCACCGCATCC和GAGCGATCGCAGATCCTTGGATCTGTATTGGACAGGCCGC，酶切体系采用Bsu15I-BamHI双酶切。

5.根据权利要求3所述的过表达载体，其特征在于，所述过表达载体通过以下方法构建得到：

将如SEQ ID NO.2的片段合成在puc57载体上作为模板扩增，将扩增产物与出发载体产物进行无缝克隆连接既得；

其中，扩增引物为AGCAGAGATCCAGTTTATCGATCCATAGAGCCCACCGCATCC和GTCATTGGTCTTAAAGGTACCTGAGGTG，酶切体系采用Bsu15I-BamHI双酶切。

6.根据权利要求4或5所述的过表达载体，其特征在于，所述出发载体通过以下方案构建得到：将如SEQ ID NO.3的片段合成在puc57载体上作为模板扩增，将扩增产物与出发载体产物进行无缝克隆连接既得。

其中，扩增引物为AAGACACCGACTCTACTAGAACCGGTGCGGCCGCGAATTC和AATCCAGAGGTTGATTGTTCCGGCGCGCCGACTGCGTCTGT，酶切体系采用EcoRI-MluI双酶切。

7.一种慢病毒表达质粒，其特征在于，通过将外源基因插入权利要求3～6中任一所述过表达载体，经转染提取质粒既得。

8.权利要求1所述的双向启动子在外源基因克隆或表达中的应用。

9.权利要求1所述的双向启动子在制备诱导两种抗原免疫应答的药物中的应用。