[发明专利]一种双向启动子及其过表达载体、慢病毒表达质粒和应用

说明书

本申请涉及基因工程技术领域，提供了一种双向启动子及其过表达载体、慢病毒表达质粒和应用，所述双向启动子包括第一启动单元和第二启动单元，分别与所述第一启动单元和第二启动单元连接的外源基因的延伸方向从5′至3′相反；或所述双向启动子由以下启动子元件组成：启动子EF1、增强子CMV enhancer和启动子CBH，在所述增强子CMV enhancer的序列中插入有Poly（A）序列，分别与所述启动子EF1和启动子CBH连接的外源基因的延伸方向从5′至3′相反。本申请双启动子构建的慢病毒表达质粒具有启动平衡和滴度高的特点。

技术领域

本申请属于基因工程技术领域，特别是一种双向启动子及其过表达载体、慢病毒表达质粒和应用。

背景技术

启动子(Promoter)是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游，能够与RNA聚合酶和其它转录因子结合并进而调节其下游目的基因转录起始和转录效率。启动子在用于设计和制备基因工程产品和基因治疗药物等方面，具有重要的应用价值。

基因治疗(genetherapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的，因此操纵基因表达、基因治疗等都是从构建质粒载体开始。慢病毒载体是以人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)来源的一种病毒载体，可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。慢病毒载体具有携带的外源基因在宿主中表达时间长、毒性低、可携带的外源基因片段大、不易诱发宿主免疫反应等优点，是一种理想的基因转移载体，已经被广泛的应用于基因治疗、疫苗生产、转基因动物、基因敲除、药物研究、生产目的蛋白细胞系等科学研究领域，如CAR-T(嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)需要使用慢病毒感染T细胞，科研中使用慢病毒作为工具病毒构建细胞系。然而慢病毒因其为RNA病毒，难以添加稳定RNA结构的polyA(多聚腺苷酸)序列，导致其载体容量有限，当需要表达两个基因时，如果使用两个启动子，启动子可能直接互相干扰而影响基因的表达，存在重组病毒的滴度低的缺陷，难以达到体内应用的需求。而选择使用IRES或2A连接基因，总有表达不稳定，添加额外蛋白序列的问题。具体为：①使用IRES串联2个基因，IRES引入了一个新的核糖体结合位点，以不依赖帽的方式翻译第二个基因，然而IRES导致第二个基因的表达降低。②使用2A序列连接两个基因，2A肽会自解离断裂为2个蛋白，然而2A序列会在第一个蛋白后额外添加序列，为了去除多余的氨基酸，可以将弗林蛋白酶切割位点整合到2A序列中，然而仍有不完全切割的风险。

基于慢病毒载体表达两个基因存在的缺陷，利用双向启动子将是一种比较理想的解决方案。双向启动子(BidirectionalPromoter)属于一种特殊类别的启动子，是位于两个相邻且转录方向相反的基因之间的一段DNA序列。由于其具有能够同时驱动其两侧邻近的排列方向相反的两个基因的转录，相比传动的单向启动子，不仅可以实现单个外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，还可以同时实现两个外源基因或外源的shRNA在宿主体内的表达，因此，在慢病毒载体中利用双向启动子进行两个基因的表达则可以有效的避免IRES或2A连接基因带来的表达缺陷。

但是申请人发现在普通载体中表现良好的双向启动子在慢病毒中具有出毒效率低的问题，主要原因可能是慢病毒为RNA病毒，病毒包装过程与双向启动子的启动有冲突有关。因此，提供一种能够平衡调控相反转录方向的两个基因表达的双向启动子，对于双基因慢病毒载体在基因工程产品和基因治疗药物中的应用具有重要的推动作用。

发明内容

针对现有技术的双向启动子在慢病毒载体的应用中存在病毒滴度低的缺陷，本申请的目的旨在提供一种双向启动子及含有该双向启动子的慢病毒表达质粒，该慢病毒表达质粒在双向启动子的作用下，可以同时以相反的方向转录表达两个目的基因，该慢病毒表达质粒具有启动平衡和滴度高的特点。另外该双向启动子及含有其的慢病毒表达质粒在基因工程产品和基因治疗药物中的应用也在本申请的范围之内。