[发明专利]一种山麦冬体细胞胚再生的方法

说明书

本发明公开了一种山麦冬体细胞胚再生的方法。包括以下步骤：(1)体胚诱导：将山麦冬无菌苗的叶片切成0.8‑1.2cm片段，接在体胚诱导培养基上，在黑暗条件下进行体胚诱导；(2)体胚增殖：将步骤(1)诱导出的体胚接在体胚增殖培养基上，黑暗条件下进行体胚增殖培养；(3)体胚出芽：将步骤(2)得到的增殖后的体胚移接至体胚出芽培养基上，黑暗培养直至发芽。本发明通过高效诱导山麦冬体细胞胚并诱导体胚出芽从而获得再生苗。可为后续山麦冬转基因提供材料，也可为转基因技术提供高效的植株再生体系。

技术领域

本发明涉及植物生物技术中的植物组织培养方法，具体地说，涉及一种山麦冬体细胞胚再生的方法。

背景技术

山麦冬(Liriope spicata(Thunb.)Lour.)是天门冬科山麦冬属的多年生草本植物。广泛分布在亚洲，我国具有丰富的野生资源。山麦冬抗逆性极强，可适应多种不良环境，如道路旁、林下、湿地、山林。且山麦冬叶细长，株型似兰花，花为白色或淡紫，花冠似蝶形，花葶挺拔矗立于叶子上方，观赏性强，具有较高的园林应用价值，适用于道路绿化、林下覆盖、庭院栽种、园林应用等场景。

目前，生产中山麦冬的繁殖方式主要为种子繁殖和分株繁殖，效率不高，且种苗遗传背景复杂、种质存在较大差异。

发明内容

本发明旨在提供一种山麦冬体细胞胚再生的方法，以山麦冬叶片为外植体，经体胚诱导、体胚增殖培养、体胚出芽诱导等过程，促进山麦冬的体胚诱导进程，加快山麦冬再生过程。从而实现本发明为后续转基因提供材料，也为转基因提供高效再生体系的目的。

本发明所提供的山麦冬体细胞胚再生的方法，包括以下步骤：

(1)体胚诱导：将山麦冬无菌苗的叶片切至0.8-1.2cm长，在体胚诱导培养基上暗培养进行体胚诱导；

(2)体胚增殖：将步骤(1)诱导后的体胚接至体胚增殖培养基上，黑暗条件下进行体胚增殖培养；

(3)体胚出芽：将步骤(2)得到的增殖后的体胚移接至体胚出芽培养基上，黑暗培养直至发芽。

上述方法步骤(1)中，在超净工作台中使用无菌工具将山麦冬无菌苗的叶片切至0.8-1.2cm(具体可为1cm)长，叶面朝上平铺至体胚诱导培养基上，黑暗培养，实现体胚诱导；

所述体胚诱导培养基的组成为：MS+2,4-D 2mg/L+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH为5.8。

所述暗培养在20-25℃温度下进行，具体可为23℃；

所述暗培养进行4-12周；

步骤(1)的体胚诱导率可达30.95％。

上述方法步骤(2)中，在超净工作台中使用尖头镊子挑取叶片上诱导出的胚性愈伤，将其堆放呈豆粒大小置于体胚增殖培养基上，黑暗培养，实现体胚增殖；

所述体胚增殖培养基的组成为：MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+葡萄糖20g/L+琼脂7g/L，pH为5.8；

所述体胚增殖培养在20-25℃温度下进行，具体可为23℃；

所述体胚增殖培养进行2-3周；

步骤(2)的增殖效果明显；

上述方法步骤(3)的操作为：将步骤(2)得到的增殖后的愈伤组织用尖头镊子转移至体胚出芽培养基上(愈伤之间留有较大空隙，以便后续发芽)，黑暗培养，出芽后，移到光下，光照培养使其变绿，从而形成正常的山麦冬无菌苗。