[发明专利]一种带荧光标签RyR2突变质粒的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种表达带荧光标签的RyR2突变蛋白的质粒，所述质粒是在RyR2突变蛋白表达质粒中的RyR2突变基因的第2801位核苷酸和第2802位核苷酸之间插入荧光标签序列后得到的质粒；

所述RyR2突变蛋白表达质粒是将RyR2野生型蛋白表达质粒中的RyR2野生型基因进行突变后得到的质粒；

所述RyR2突变蛋白为将鼠源的RyR2野生型蛋白氨基酸序列第1761位的精氨酸突变为色氨酸后得到的蛋白或人源的RyR2野生型蛋白氨基酸序列第1760位的精氨酸突变为色氨酸后得到的蛋白。

2.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于：所述RyR2突变基因为将RyR2野生型基因第5281位的胞嘧啶突变为胸腺嘧啶后得到的基因。

3.根据权利要求1或2所述的质粒，其特征在于：所述荧光标签序列为序列表中序列5所示的DNA分子。

4.根据权利要求1-3任一所述的质粒，其特征在于：所述RyR2野生型蛋白表达质粒为mRyR2-pcDNA5质粒。

5.权利要求1-4任一所述质粒的构建方法，包括如下步骤：

a1)以RyR2野生型蛋白表达质粒为模板，采用引物P1f和引物P1rm进行PCR扩增，得到PCR产物P1；以所述RyR2野生型蛋白表达质粒为模板，采用引物P2fm和引物P2r进行PCR扩增，得到PCR产物P2；

所述引物P1f为序列表中序列1所示的单链DNA分子；

所述引物P1rm为序列表中序列2所示的单链DNA分子；

所述引物P2fm为序列表中序列3所示的单链DNA分子；

所述引物P2r为序列表中序列4所示的单链DNA分子；

a2)以所述PCR产物P1和所述PCR产物P2为模板，采用所述引物P1f和所述P2r进行PCR扩增，得到PCR产物P3；

a3)用ClaI和BsiWI限制性内切酶对所述RyR2野生型蛋白表达质粒进行酶切反应，得到RyR2野生型蛋白表达质粒酶切物；用ClaI和BsiWI限制性内切酶对所述PCR产物P3进行酶切反应，得到P3酶切物；

a4)将所述RyR2野生型蛋白表达质粒酶切物和所述P3酶切物连接，得到RyR2突变蛋白表达质粒；

a5)以所述RyR2突变蛋白表达质粒为模板，采用引物F1和引物R1进行PCR扩增，得到RyR2分段扩增产物甲；以所述RyR2突变蛋白表达质粒为模板，采用引物F2和引物R2进行PCR扩增，得到RyR2分段扩增产物乙；

所述引物F1为序列表中序列6所示的单链DNA分子；

所述引物R1为序列表中序列7所示的单链DNA分子；

所述引物F2为序列表中序列8所示的单链DNA分子；

所述引物R2为序列表中序列9所示的单链DNA分子；

a6)将荧光标签序列、所述RyR2分段扩增产物甲和所述RyR2分段扩增产物乙进行无缝克隆连接，得到所述表达带荧光标签的RyR2突变蛋白的质粒。

6.成套引物组或成套试剂，所述成套引物组由序列表中序列1所示的单链DNA分子、序列表中序列2所示的单链DNA分子、序列表中序列3所示的单链DNA分子、序列表中序列4所示的单链DNA分子、序列表中序列6所示的单链DNA分子、序列表中序列7所示的单链DNA分子、序列表中序列8所示的单链DNA分子和序列表中序列9所示的单链DNA分子组成；

所述成套试剂由所述成套引物组、RyR2野生型蛋白表达质粒、ClaI限制性内切酶、BsiWI限制性内切酶和荧光标签序列组成。

7.根据权利要求5所述的方法或权利要求6所述的成套引物组或成套试剂，其特征在于：

所述荧光标签序列为序列表中序列5所示的DNA分子；

或，所述RyR2野生型蛋白表达质粒为mRyR2-pcDNA5质粒。