[发明专利]一种带荧光标签RyR2突变质粒的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种带荧光标签RyR2突变质粒的构建方法及其应用。所述带荧光标签RyR2突变质粒是在RyR2突变蛋白表达质粒中的RyR2突变基因的第2801位核苷酸和第2802位核苷酸之间插入荧光标签序列后得到的质粒；所述RyR2突变蛋白表达质粒是将RyR2野生型蛋白表达质粒中的RyR2野生型基因进行突变后得到的质粒；所述RyR2突变蛋白为将鼠源的RyR2野生型蛋白氨基酸序列第1761位的精氨酸突变为色氨酸后得到的蛋白或人源的RyR2野生型蛋白氨基酸序列第1760位的精氨酸突变为色氨酸后得到的蛋白。本发明为RyR2研究提供了方法学保障，对研究心血管疾病中RyR2的病理生理机制具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种带荧光标签RyR2突变质粒的构建方法及其应用。

背景技术

Ryanodine Receptor 2(RyR2)是心肌细胞兴奋收缩耦联的重要离子通道蛋白，由四个足状结构的亚单位组成的同源四聚体，形成一个大的四叶草状结构，横跨心肌细胞肌浆网之间的间隙，是迄今为止发现的肌浆网膜上最大的离子通道。RyR2在介导心肌细胞Ca²⁺流中发挥非常关键的作用，其调控机制十分复杂，RyR2功能障碍造成的钙外流阈值改变导致钙异常释放是引起致死性心律失常和心力衰竭的病理基础。RyR2的基因突变、结构改变、功能障碍或与相关蛋白的相互作用异常均可造成RyR2受体的钙释放阈值降低，引起肌浆网钙异常释放，诱发或加重多种心脏疾病。

儿茶酚胺敏感性多形性室速(catecholaminergic polymorphic ventriculartachycardia，CPVT)是一种遗传离子通道疾病，是年轻人猝死的主要原因之一，约60％CPVT患者携带RyR2基因突变。心房颤动是临床上最常见的心律失常，其发病机制十分复杂，当心房颤动发生时，RyR2功能改变，其介导的自发性钙释放增加，并引起持续性心房颤动。心力衰竭是各种心脏疾病导致心功能不全的一种综合征，绝大多数情况下指心肌收缩力下降使心排血量不能满足机体静脉回流及身体组织代谢的需要，并由此产生一系列症状和体征。心力衰竭是一个慢性的高肾上腺素能状态，RyR2过磷酸化使通道开放性增强，肌浆网钙异常释放，导致后续的心脏收缩异常和心律失常发生。在心力衰竭患者的心脏中，RyR2过磷酸化导致通道功能丧失。

由于RyR2参与了多种心脏疾病的发生，包括心律失常、心肌肥厚和心力衰竭等，针对RyR2的分子学、细胞学、动物学研究一直是心脏疾病研究的热点，因此，在体外实验过程中构建表达RyR2突变的细胞是RyR2相关疾病基础研究的重要基础。然而鉴于RyR2蛋白分子量非常大，具有独特的表达特点，构建表达RyR2突变的质粒难度系数非常高。目前国内只有少数实验室具有构建RyR2质粒的能力，国内众多研究者只能通过国外团队馈赠的方式对RyR2进行研究，因此，探索出RyR2质粒的构建方法对国内RyR2相关疾病的研究发展至关重要。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种表达带荧光标签的RyR2突变蛋白的质粒。

本发明提供的表达带荧光标签的RyR2突变蛋白的质粒是在RyR2突变蛋白表达质粒中的RyR2突变基因的第2801位核苷酸和第2802位核苷酸之间插入荧光标签序列后得到的质粒；

所述RyR2突变蛋白表达质粒是将RyR2野生型蛋白表达质粒中的RyR2野生型基因进行突变后得到的质粒；

所述RyR2突变蛋白为将鼠源的RyR2野生型蛋白(mRyR2野生型蛋白)氨基酸序列第1761位的精氨酸(R)突变为色氨酸(W)后得到的蛋白或将人源的RyR2野生型蛋白(hRyR2野生型蛋白)氨基酸序列第1760位的精氨酸(R)突变为色氨酸(W)后得到的蛋白。由于RyR2基因序列在不同种属中高度保守，hRyR2野生型蛋白第1760位氨基酸位点相当于mRyR2野生型蛋白第1761位氨基酸位点。