[发明专利]一种小鼠听觉神经元永生细胞系及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及永生化细胞技术领域，尤其涉及一种小鼠听觉神经元永生细胞系及其构建方法和应用。本发明通过分离小鼠内耳螺旋神经节细胞后，利用SV40LT过表达慢病毒载体（EF1α‑SV40‑IRES‑puromycin载体元件）转染螺旋神经节细胞，并筛选转染成功的细胞，获得与原代小鼠内耳螺旋神经节细胞性状无明显差别的小鼠听觉神经元永生细胞系SIO‑SGN1，该永生细胞系可以稳定传代，实现内耳螺旋神经节细胞的离体培养和传代，为听觉研究提供便利条件。且该永生细胞系体外培养条件简单，传代速度快，是可以稳定用于听觉研究的细胞工具。

技术领域

本发明涉及永生化细胞技术领域，尤其涉及一种小鼠听觉神经元永生细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

耳聋已成为全球性的重大公共卫生问题，据世界卫生组织统计，目前全球约有15亿人患有不同程度的耳聋障碍，占世界总人口的19。耳聋障碍对于耳聋患者家庭、社会以及耳聋患者自身都造成了严重影响。耳聋发生机制复杂，且易受环境、药物、年龄等多种因素的影响，因此对于耳聋发生的机制及预防和治疗方法的研究仍需进一步深入。

作为内耳中的听觉神经元，螺旋神经节细胞是听觉传导通路上的第一级神经元，能够将来自毛细胞的声音信号转变成电信号并向上传导到大脑听觉中枢，从而形成听觉。因此，螺旋神经节神经元在听觉传导过程中起着十分重要的作用，也是现在听觉研究的重点对象。然而，由于内耳当中细胞类型众多，普通的分离培养方法难以获得纯化的螺旋神经节细胞，并且螺旋神经节神经元属于终末分化细胞，在体外培养过程中难以传代，且在体外培养时对于培养环境要求严格、存活时间有限，如文献Wei, D., et al., Survival,synaptogenesis, and regeneration of adult mouse spiral ganglion neuronsinvitro. Journal of Neurobiology, 2007. 67（1）: p. 108-122和Yan, W., et al., AThree-Dimensional Culture System with Matrigel Promotes Purified SpiralGanglion Neuron Survival and Function In Vitro. Mol Neurobiol, 2018. 55（3）:p. 2070-2084，因此限制了其在内耳研究中的应用。需要采用永生化技术建立永生化的小鼠听觉神经元细胞系。

发明内容

本发明针对现有技术问题，发明人通过对永生化小鼠内耳听神经元进行了研究，分离小鼠内耳螺旋神经节细胞后，利用含有EF1α-SV40-IRES-puromycin载体元件的SV40LT过表达慢病毒载体转染螺旋神经节，并筛选转染成功的细胞，获得与原代小鼠内耳螺旋神经节细胞性状无明显差别的小鼠听觉神经元永生细胞系SIO-SGN1，该永生细胞系可以稳定传代，实现内耳螺旋神经节细胞的离体培养和传代，为听觉研究提供便利条件。且该永生细胞系体外培养条件简单，传代速度快，是可以稳定用于听觉研究的细胞工具。

首先，本发明所述的小鼠听觉神经元永生细胞系，其保藏编号为CCTCC NO：C202275。

本发明所述的小鼠听觉神经元永生细胞系，通过如下方法构建获得，具体过程为：

（1）C57小鼠听觉神经元细胞的分离培养：将出生1d的C57小鼠取耳蜗解剖蜗轴并酶解消化，重悬单细胞后铺瓶培养；

（2）对分离细胞进行免疫荧光鉴定：细胞爬片后进行免疫荧光染色，观察神经元标记物的染色情况；

（3）采用SV40LT过表达慢病毒转染C57小鼠听神经元细胞：利用SV40LT过表达慢病毒载体（EF1α-SV40-IRES-puromycin载体元件）转染螺旋神经节。转染后，细胞扩增3-4代后进行筛选；

（4）C57小鼠听神经元细胞的筛选：利用嘌呤霉素筛选转染成功的细胞。