[发明专利]一种成年鸡卵原干细胞的体外分离培养方法及其应用

权利要求书

1.一种鸡卵原干细胞的体外分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将成年鸡卵巢的皮质部分破碎成组织团块，用包含双抗的PBS缓冲液漂洗，静置后得到下层的组织团；用胰酶消化处理组织团，将消化处理后的组织团用磁珠活化细胞分选缓冲液进行重悬，加入一抗，孵育10-20min；然后再加入Anti-mouse IgM二抗磁珠，共孵育20-30min；用磁珠活化细胞分选缓冲液进行洗脱，收集包含目的细胞的洗脱液；

(2)将包含目的细胞的洗脱液依次进行原代培养、传代培养，即体外分离培养得到鸡卵原干细胞。

2.根据权利要求1所述的体外分离培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述包含双抗的PBS缓冲液中含有的双抗为1X antibiotic-antimycotic(抗生素-抗真菌剂)。

3.根据权利要求1所述的体外分离培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述一抗为阶段特异性胚胎抗原-1。

4.根据权利要求1所述的体外分离培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述磁珠活化细胞分选缓冲液为含有1％(体积分数)胎牛血清和2mM EDTA的D-PBS缓冲液。

5.根据权利要求1所述的体外分离培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述原代培养是以鸡胚成纤维细胞作为饲养层。以含有体积分数为2.5％鸡血清、体积分数为7.5％胎牛血清、1.2mM丙酮酸钠、1X antibiotic-antimycotic、1X GlutaMax、1X EmbryoMaxNucleosides、0.1mMβ-巯基乙醇、1X NEAA、1X B-27supplement、6ng/ml hFGFb和25ng/mLHuman Activin A的KO-DMEM终浓度的培养基为培养液。

6.根据权利要求1所述的体外分离培养方法，其特征在于，步骤(2)中，原代培养的条件为：39℃、5％CO₂。

7.根据权利要求1所述的体外分离培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述传代培养是将处于对数生长期的鸡卵原干细胞克隆吸出，用0.25％胰酶消化处理，分散成单细胞或若干小细胞团后接种至新的鸡胚成纤维细胞饲养层上继续培养。

8.由权利要求1-7任一项所述的体外分离培养方法制备的鸡卵原干细胞。

9.权利要求8所述的鸡卵原干细胞在如下(1)或(2)中的应用：

(1)延长鸡的产蛋周期；

(2)提高鸡的繁殖性能。